[发明专利]一种真鲷虹彩病毒的实时定量PCR检测方法

摘要

本发明是属于真鲷虹彩病毒感染的检测技术领域，涉及一种采用荧光探针或SYBR GREEN I荧光染料的实时定量聚合酶链式反应(PCR)技术的检测方法，特别是一种真鲷虹彩病毒的实时定量PCR检测方法，先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后建立实时定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线，最后建立待测样品的结果判定依据；具有检测方法简单，检测速度快，效果好，定量准确，特异性强，灵敏度高等优点。

主权项

一种真鲷虹彩病毒的实时定量PCR检测方法，先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后建立实时定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线，最后建立待测样品的结果判定依据，其特征在于所述的设计特异性引物序列和荧光探针序列是选取真鲷虹彩病毒的衣壳蛋白基因保守序列，利用Primer Express 3.0软件设计特异性引物序列和荧光探针序列，为：正向引物RSIV-F：5′-GGGCGGCGGAACCA-3′反向引物RSIV-R：5′-TGCAATAACGACCAGTTCAAACTT-3′荧光探针RSIV-T：5′-FAM-AGCGGCTACACGGTCGCCCA-TAMRA-3′；荧光探针的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA，扩增片断长度为64bp；所述的建立实时定量PCR反应体系和反应程序是先采用DNA提取试剂盒提取待测样品的DNA，再通过调整实时定量PCR各组分的用量，以定量PCR仪器检测到高荧光信号和低循环阈值为依据，建立定量PCR的反应体系和反应程序；所述的制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线是先设计包含实时定量PCR扩增区域的正链引物和负链引物，扩增真鲷虹彩病毒得到扩增产物，按分子克隆操作方法制备质粒并提取质粒DNA为标准品；将标准品测定浓度并梯度稀释后进行实时定量PCR反应；定量PCR仪器计算循环阈值，根据标准品的浓度和循环阈值，软件自动绘制出标准曲线；所述的建立待测样品的结果判定依据是利用实时定量PCR仪器收集荧光信号，再利用分析软件处理数据，得到扩增曲线、熔解曲线和循环阈值，以最低浓度的标准品对应的循环阈值作为待测样品的判定界限，以标准品对照的Tm值作为SYBRGREEN I荧光染料的判定依据。