[发明专利]一种真鲷虹彩病毒的实时定量PCR检测方法

说明书

技术领域：

本发明是属于真鲷虹彩病毒感染的检测技术领域，涉及一种采用荧光探针或SYBRGREEN I荧光染料的实时定量聚合酶链式反应(PCR)技术的检测方法，特别是一种真鲷虹彩病毒的实时定量PCR检测方法。

背景技术：

真鲷虹彩病毒(Red-sea bream iridovirus，RSIV)属于虹彩病毒科，细胞肿大病毒属，是目前对各国海水养殖危害最为严重的疾病之一，给水产养殖业带来巨大的损失，同时严重影响经济鱼类的进出口贸易。鉴于虹彩病毒的危害性，RSIV虹彩病毒被列为OIE必检疫病名录，我国在2008年新公布的“一、二、三类动物疫病病种名录”(中华人民共和国农业部公告第1125号)中将其列为二类疫病。韩国自2008年12月22日起，开始实施新的“水生动物疾病管理法”，其中，真鲷虹彩病毒(传染性脾肾坏死病毒，ISKNV)被列为检疫项目，在真鲷、牙鲆、眼斑拟石首鱼(美国红鱼)、鲻鱼、石斑鱼、大黄鱼、花鲈、条纹鲈、大嘴鲈、星鲽、石鲷等35种鱼类进行该病的检验检疫，建立快速、灵敏、准确的真鲷虹彩病毒的检测方法是业界正在探究的核心技术课题。已有的真鲷虹彩病毒的检测方法一般分为四种：一是细胞分离培养：该方法被认为是病毒分离鉴定的黄金法则，可靠性强但操作时间较长，使用细胞培养的方法分离病毒后，需要与其它免疫学和分子生物学的方法进一步确诊，目前，用于分离真鲷虹彩病毒的细胞系很少，且敏感性差。二是电镜观察：电镜观察在水生动物的病毒鉴定中一直扮演着非常重要和直观的角色，通过对感染病毒的细胞或组织(肝、脾、肾、脑)电镜观察不但可以看到直接的包涵体和病毒的形态特征，对病毒进行初步的分类和诊断，同时，还可以通过对不同感染阶段的连续电镜观察，了解病毒在宿主组织里的增殖过程和增殖方式，使用电镜观察到病毒粒子后，同样需要进一步的免疫学或分子生物学的方法进行确诊。三是免疫学方法：根据OIE水生动物疾病诊断手册，免疫学方法可以确诊虹彩病毒的不同属，但属间经常有交叉反应；其由于多数虹彩病毒不能通过免疫兔等得到足够量的抗特定虹彩病毒的中和抗体，所以不能使用中和试验来鉴定虹彩病毒；间接荧光抗体试验(IFAT)和酶连免疫试验(ELISA)等被采用作为OIE认可的确诊方法并对其具体操作做了具体规定；抗原捕获ELISA可以代替病毒分离法，作为诊断传染性造血器官坏死病毒(EHNV)的一种途径，但对于不同的宿主，其灵敏度和特异性不尽相同。四是分子生物学方法：OIE同时谨慎地接受了PCR作为一种诊断方法，使用编码真鲷虹彩病毒的DNA聚合酶基因一段保守片段设计引物，可以从感染虹彩病毒的水生动物的细胞系和有关组织(肝、脾、脑、肾)中扩增出目的片断，并需要对扩增片段进行测序以对扩增结果进行进一步的确定，但同时，要设立阳性和阴性对照，防止假阳性和假阴性的出现，该方法只能进行定性检测，不能进行定量检测。归结起来，现有的检测方法普遍存在着检测步骤复杂，敏感性差，操作过程不易控制，检测结果准确度小和不易进行定量分析等缺点。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求提供一种利用荧光探针(Taqman探针)或SYBR GREEN I荧光染料定量检测真鲷虹彩病毒的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后建立实时定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线，最后建立待测样品的结果判定依据；所述的设计特异性引物序列和荧光探针序列是选取真鲷虹彩病毒的主要衣壳蛋白(MCP)基因保守序列，利用已有的Primer Express 3.0软件设计特异性引物序列和荧光探针序列，为：

正向引物RSIV-F：5′-GGGCGGCGGAACCA-3′

反向引物RSIV-R：5′-TGCAATAACGACCAGTTCAAACTT-3′

荧光探针RSIV-T：5′-FAM-AGCGGCTACACGGTCGCCCA-TAMRA-3′；