本发明提供了一种快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记C27449及其应用。所述分子标记C27449的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,用于检测所述分子标记C27449的引物对的核苷酸序列分别为:C27449F:TCATCCAAGTTCCAGCCT和C27449R:GGTCCCCCACAACATACA。所述分子标记C27449可以不受日本对虾组织特异性及环境的影响,使用步骤简单,结果明显,将日本对虾的基因组DNA与引物对进行PCR反应后电泳检测,若在120bp出现条带,则为雌性日本对虾,若无条带,则为雄性日本对虾,该分子标记还可以促进日本对虾全雌或高雌苗种培育技术的建立,具有广阔的应用前景。