[发明专利]用固相法检测生物活性物质

说明书

技术领域

本发明一般来说涉及检测、鉴定有生物活性的物质的性质、含量和分子活性的方法。更具体地说，本发明是关于用固相法测量酶活性、酶抑制剂、凝集素、受体和其它具有生物活性分子的技术。背景技术

配位结合测定，在已知的免疫检测中常用，它基于抗体鉴别原理，对物质进行定量(参阅Stites et al，《基础临床免疫》，第8版Appleton & lange出版社，第170-176页，综述)。然而，免疫检验有两个缺点：第一个缺点是，它需要大量抗体与相应物质结合。第二个缺点是，即使物质被鉴定有生物活性，例如酶，此方法也只能鉴定它的存在，而不能测量其活性水平。

虽然有许多检测酶活性、受体功能等方法，但应用此固相法技术不但能精确测量极少量的组份，而且可以省去物理分离步骤，还可以对大批样品进行常规检验。

例如，酶在生化反应中起关键性的作用，在有关生物学领域，如医药，食品，制药业方面测定酶活性都显得十分重要。现在通用的酶检测方法，其原理都基于酶催化底物过程中产物的形成(Loround,1981；Rossomando,1990)。尽管这些方法是许多生物研究中的主流，但是研究不仅要测量其活性的存在，还要将其量化。这一点对于那些不遵守米氏运动常数的酶，如别构酶和那些活泼的共价修饰酶尤为重要。

另外，需要定量可能存在于生物系统中的酶抑制剂含量。这一点在医药领域受到极大重视，在研究爱滋病过程中发现一些酶的抑制剂(Miller etal 1989)或抑制剂的生长控制血压(Ondetti et al 1982)或包括象青霉素这些抗生素的水解(Cullman,1990)。

急需一种能够自动检测酶的方法，特别是在制药业，在此，酶通常用做发现新药的靶物质。在探求一种新药的过程中，需要过滤掉成千上万的混合物。这一新方法的改进不仅为自动高效过滤提供方便，而且在许多其他应用上将大大降低成本。另外，对于酶来说高效自动分离对于测定受体和凝集素也是必须的。

例如，有一个简便可信的检测β-葡聚糖酶的方法，该酶对酿酒和家禽养殖中所需的大麦β-葡聚糖的水解过程中起着重要作用。对于该检测据报道有好多种，如粘度计法(Boume and Pierce,1970)，蔗糖还原法(Denalt etal,1978)，径向胶扩散法(Edney et al,1986；Martin and Bamforth 1983)和偶氮-大麦葡聚糖法(McClearly and Shameer,1987)。迄今为止，任何对成品饲料中的酶检测和定量都面临克服仪器的灵敏度和饲料自身复杂性的技术问题。若有一个改进的高度灵敏的光度计法，特别是它能使检测高水平的自动化，将十分受欢迎，微量滴定技术采用微量滴定板和微量滴定板读取器将大大方便检验工作。

在这个研究方向上有两个分支：一个是(Wirth和Wolf 1992)应用微量滴定板比色法，这一实验方法的原理与偶氮-大麦葡聚糖法一样，只是它在微量滴定板孔内读取吸收值，这个操作过程与偶氮-大麦葡聚糖法的缺点一样需要沉淀和离心步骤，其灵敏度也未达到很高水平；另一个方向是利用酶的免疫特性对酶的含量进行定量(Buhler,1991；Rafael et al1995)，这一技术的主要缺点是它不能够评估特殊酶的活性。免疫检测估计的是酶蛋白的含量，而不是酶的生物活性，所以这一检测方法只能用于抗体高度特异性的种间关系十分近的酶检测。在近期Headon(1993)的综述中，得出这样结论：迄今为止还没有报道过一个合适的检测和定量酶的方法，这可能部分原因是通常无法检测低水平的酶。

所以说，获得一个简便灵敏和有效的检测蛋白酶活性的方法将对于重组蛋白工业测试内源水解蛋白酶的活性，以及新药发现过程中过滤蛋白酶抑制剂以及诊断和常规研究有极大帮助。然而，用现在通用的方法由于有灵敏度不高(例如酪蛋白胶)，繁琐的操作步骤(例如三氯乙酸沉淀，离心和加热)，同位素辐射的危险(例如放射性标记底物)以及需要昂贵的仪器(例如荧光极化分析仪)等缺陷，所以不能满足需要而且这些方法既费时又无法自动化。发明简述

根据本发明，公开了一种应用固相法检测生物活性量和/或生物活性物质量的方法。该方法是提供应用物质自身生物活性进行检验的方法。