[发明专利]一种T7 RNA聚合酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种T7RNA聚合酶突变体及其制备方法和应用，属于核酸工具酶技术领域。所述T7RNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，由野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的640位甘氨酸被色氨酸取代制得。与野生型T7噬菌体的RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体的催化活性更高、热稳定性更好，与目前市场上相关聚合酶的RNA合成水平相比，RNA的产量提高了30‑50％。本发明还提供了一种T7RNA聚合酶突变体的分离纯化方法，通过优化纯化工艺，制备的T7RNA聚合酶的样品中不含有DNase、RNase污染。

技术领域

本发明涉及核酸工具酶技术领域，具体涉及一种T7 RNA聚合酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

随着科技和生物技术的快速发展，RNA相关研究和应用的大量开展，对RNA合成提出了很高的挑战，目前RNA体外合成包括化学合成和酶法合成两种方法，其中化学合成法适用于合成几十个核苷酸长度的RNA，随着RNA长度的增加，生产成本会急剧上升。当核苷酸达到一百个以上时，化学合成法已不再适用，而通常情况下编码蛋白质的mRNA含有几千个核苷酸，所以酶法合成是当前制备长链RNA的唯一方法。

噬菌体T7 RNA聚合酶(T7 RNA Polymerase，T7RNAP)于1970年首次从噬菌体T7感染的大肠杆菌细胞中分离出来，是催化RNA合成的最简单的酶之一。T7 RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的的DNA或DNA复制品。近年来T7RNA聚合酶转录系统在合成生物学中也呈现出重要作用，T7RNAP广泛应用于RNA的体外合成、体内蛋白表达(细菌高表达系统)。因此高活性、高稳定性的T7 RNA聚合酶构建表达及纯化工艺研究，成为研究热点之一。

利用蛋白质工程改造技术对T7 RNA聚合酶进行定点突变以获得功能改善的突变体是T7 RNA聚合酶产品开发的手段之一。现有技术中，专利文献CN102177236A公开通过将野生型T7 RNA聚合酶氨基酸序列中的786位的谷氨酰胺、179位的赖氨酸以及685位的缬氨酸中至少一个位置的氨基酸残基被其他氨基酸取代，提高了其热稳定性和比活力。又例如专利文献CN 107460177A公开将野生型T7 RNA聚合酶氨基酸序列中的632位的精氨酸被半胱氨酸取代，转录活力提高。

基于T7 RNAP的表达系统，研究者开发出谷氨酸棒杆菌MB001和大肠杆菌BL21(DE3)两个底盘菌株。如何从底盘菌株的发酵产物中分离纯化获得得率高、纯度高、活力好的T7 RNA聚合酶是本领域技术人员需要解决的问题。

随着纯化工艺研究的快速发展，不论是小分子单体还是大分子蛋白的纯化方法越来越多，重组蛋白纯化工艺需要注意以下问题：1)重组蛋白若是胞内表达，破胞处理过程中，保护目的蛋白的结构及活性。2)每一步分离纯化的步骤都会造成一定量的蛋白及蛋白活性损失，但分离步骤太少又不能达到一定的纯度标准；3)每个分离纯化环节中所用的试剂及相关操作对不同的蛋白影响适用范围都是不同的；4)常规的分离纯化方法获得的T7RNA聚合酶的样品中通常会有存在DNase，RNase污染。因此，针对特定目标蛋白摸索一套合适的纯化方法也是目前开发高活力T7 RNA聚合酶产品需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于利用基因工程改造技术对野生型T7RNA聚合酶的氨基酸进行取代，获得一种酶活力和热稳定性显著提升的T7 RNA聚合酶突变体，并且通过优化分离纯化工艺条件，制备出无DNase、RNase污染的T7 RNA聚合酶产品。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明通过采用基因工程方法将野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的640位的甘氨酸(G)用色氨酸(W)取代，获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的T7RNA聚合酶突变体G640W。

与野生型T7噬菌体的RNA聚合酶相比，T7RNA聚合酶突变体G640W的热稳定性和比活性有较大提高。