[发明专利]一种T7 RNA聚合酶突变体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种T7 RNA聚合酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种编码如权利要求1所述的T7 RNA聚合酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种包含如权利要求2所述的编码基因的重组载体。

4.一种包含如权利要求3所述的重组载体的重组基因工程菌。

5.一种无DNase和RNase污染的T7 RNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将包含核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段的重组表达载体转入大肠杆菌宿主细胞中，得到重组基因工程菌，所述重组表达载体具有His标签编码序列；

(2)将所述重组基因工程菌发酵培养后离心收集菌体，加入细胞裂解液，超声破碎后离心取上清，过滤得到亲和层析上样液；

所述细胞裂解液的组成包括：20-50mM Tris-HCl，10-50mM NaCl，3-10mM EDTA，3％-10％甘油，10-20μg/mL溶菌酶，0.005％-0.010％脱氧胆酸钠，3-8mM二硫苏糖醇，0.1-0.5mM苯甲脒，20-80μg/mL苯甲基磺酰氟，10-40μg/mL杆菌肽，5-15mM硫酸铵，pH＝7.5-8.0；

(3)将亲和层析上样液上样到装有Ni-IDA填料的亲和层析柱，先用亲和层析洗杂液洗脱杂质，然后在280nm紫外检测波长下，采用亲和层析洗脱液洗脱至开始起峰时，收集洗脱液，利用储存液透析后得到离子交换层析上样液；

所述亲和层析洗杂液的组成包括：20-60mM磷酸盐缓冲液，0.2-0.5MNaCl，30mM咪唑，pH＝7.5-8.0；

所述亲和层析洗脱液的组成包括：20-60mM磷酸盐缓冲液，0.2-0.5MNaCl，100mM咪唑，pH＝7.5-8.0；

所述储存液的组成包括：30-50mM Tris-HCl，4-8mM EDTA，0.1％-0.2％Triton X-100，45-55％甘油，pH＝7.5-8.0；

(4)将离子交换层析上样液上样到装有DEAE-650M填料的离子交换层析柱，先用离子交换层析洗杂液洗脱杂质，然后在280nm紫外检测波长下，采用离子交换层析洗脱液洗脱至开始起峰时，收集洗脱液，制得所述T7 RNA聚合酶突变体；

所述离子交换层析洗杂液的组成包括：20-80mM Tris-HCl，100mM NaCl，0.1％-0.3％Triton X-100，3％-8％甘油，pH＝7.5-8.0；

所述离子交换层析洗脱液的组成包括：20-80mM Tris-HCl，200mM NaCl，0.1％-0.3％Triton X-100，3％-8％甘油，pH＝7.5-8.0。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，细胞破碎上清液采用亲和层析缓冲液A稀释后过滤，制得亲和层析上样液；

所述亲和层析缓冲液A的组成包括：20-60mM磷酸盐缓冲液，0.2-0.5M NaCl，3-10mM咪唑，pH＝7.5-8.0。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，上样前，先用无核酸酶水冲洗层析柱，再用亲和层析缓冲液A进行柱平衡；上样后，先采用亲和层析缓冲液A平衡。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，上样前，先用无核酸酶水冲洗层析柱，再用离子交换层析缓冲液A进行柱平衡；上样后，先采用离子交换层析缓冲液A平衡；

所述离子交换层析缓冲液A的组成包括：20-80mM Tris-HCl，10-50mM NaCl，0.1％-0.3％Triton X-100，3％-8％甘油，pH＝7.5-8.0。