[发明专利]一种高产肌醇解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)及以其为出发菌株构建的重组菌株，所述解淀粉芽孢杆菌的名称为：G2‑9，分类名称为：解淀粉芽孢杆菌，保藏编号为：CGMCCNO.26351，保藏日期：2022年12月27日。本发明在选用特定菌种CGMCCNO.26351进行基因工程手段构建高产肌醇重组菌株的基础上，通过发酵过程控制技术以进一步提高肌醇产率并稳定发酵过程。选用价格低廉的蔗糖作为底物，具有更低的生产成本及极高的转化率，发酵过程中底物蔗糖利用率贴近100％，转化率最高可达143.33％，同时排废环境压力更小，更适合工业化生产。

技术领域

本发明属于基因工程技术和代谢过程控制技术领域，尤其是一种高产肌醇解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

肌醇，又名环己六醇，广泛分布于动物和植物体内，是动物、微生物的生长因子，游离态的肌醇主要存在于肌肉、心脏、肺脏和肝脏中，是磷脂的一种磷脂酰肌醇组成成分，在医药、食品、饲料等领域内具有很大的实用价值。近年来，随着对肌醇的深入研究，结合当前消费者对健康饮食诉求的不断提高，国内外市场对肌醇的需求正在逐年增加。

传统生产肌醇主要以水解提取法和化学合成法为主，今年随着肌醇年需求量不断递增、生态环境的要求、生产成本的诉求，致使国内外科研工作者更多倾向于用微生物法解决肌醇的生产矛盾。

随着近几十年来细胞生物学相关研究的不断深入，肌醇在解淀粉芽孢杆菌、酵母菌、大肠杆菌等代谢途径已基本清晰，但自然选育菌株的肌醇产率通常较低，单纯采用基因工程构建高产肌醇菌株的难度偏大且成功率较低，因此，同时考虑基因工程和发酵代谢控制技术，以具备清晰基因组信息及成熟基因操作工具的解淀粉芽孢杆菌进行改造，兼用发酵代谢过程控制的手段，获得高产肌醇的生产菌株及发酵技术。

因此，在明确出发菌株肌醇代谢途径及通路的情况下，采用基因工程技术构建重组菌株，同时结合发酵代谢控制技术对生产肌醇的发酵技术进行优化，以进一步提高肌醇的产量，解决了本领域技术人员底物利用率低、生产成本高的产业化问题。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高产肌醇解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，所述解淀粉芽孢杆菌的名称为：G2-9，分类名称为：解淀粉芽孢杆菌，保藏编号为：CGMCCNO.26351，保藏日期：2022年12月27日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

一株以如上所述的解淀粉芽孢杆菌为出发菌株构建的重组菌株。

如上所述的重组菌株的构建方法，包括如下步骤：

以解淀粉芽孢杆菌野生型CGMCC26351为出发菌株，采用同源重组系统对其基因编辑，敲除肌醇降解途径关键酶肌醇分解酶EC5.3.99.11，对影响肌醇合成的途径进行改造，顺序完成插入肌醇-3-磷酸合成酶EC5.5.1.4，替换6-磷酸果糖激酶EC2.7.1.11，敲除磷酸己糖异构EC5.3.1.9，以及替换葡萄糖苷酶EC2.7.1.2，得到重组菌株；

其中，肌醇分解酶EC5.3.99.11的基因序列为SEQ ID NO.1，肌醇-3-磷酸合成酶EC5.5.1.4的基因序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4，6-磷酸果糖激酶EC2.7.1.11的基因序列为SEQ ID NO.5，磷酸己糖异构EC5.3.1.9的基因序列为SEQ IDNO.9，葡萄糖苷酶EC2.7.1.2的基因序列为SEQ ID NO.10。

进一步地，具体包括如下步骤：