[发明专利]一组鸭茅cpSSR标记引物及其应用

权利要求书

1.一组鸭茅cpSSR标记引物，其特征在于，包含4对多态性标记引物，其引物的核苷酸序列如下所示：

cpSSR1正向引物如SEQ ID NO.1所示；

cpSSR1反向引物如SEQ ID NO.2所示；

cpSSR2正向引物如SEQ ID NO.3所示；

cpSSR2反向引物如SEQ ID NO.4所示；

cpSSR3正向引物如SEQ ID NO.5所示；

cpSSR3反向引物如SEQ ID NO.6所示；

cpSSR4正向引物如SEQ ID NO.7所示；

cpSSR4反向引物如SEQ ID NO.8所示。

2.一种含有如权利要求1所述鸭茅cpSSR标记引物的试剂盒。

3.一种如权利要求1所述鸭茅cpSSR标记引物的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

1)提取鸭茅的叶绿体DNA；

2)对步骤1)中得到的叶绿体DNA进行高通量Illumina测序；

3)使用fastp软件对步骤2)中测序所得的原始数据进行过滤；

4)采用SPAdes 2软件对步骤3)中过滤所得的数据进行叶绿体基因组的组装；

5)利用MISAperl脚本软件搜索步骤4)中所得鸭茅亚种叶绿体基因组中分布的SSR位点；

6)利用Primer Premier 5软件进行cpSSR引物设计，并筛选得到如权利要求1中所述的4对鸭茅cpSSR标记引物；

其中，步骤5)中MISAperl脚本软件的参数设定为：单核苷酸重复序列，重复单元≥8；二核苷酸重复序列，重复单元≥5；三核苷酸重复序列，重复单元≥3；四、五、六核苷酸重复序列，重复单元≥3；

步骤6)中cpSSR引物设计的设计原则为：引物长度范围20个碱基；退火温度范围50～60℃；产物长度200～300bp。

4.如权利要求1所述的鸭茅cpSSR标记引物在鸭茅亚种群体结构和物种鉴定上的应用。

5.一种基于权利要求1所述的鸭茅cpSSR标记引物进行鸭茅亚种群体结构和物种鉴定的方法，其特征在于，包含如下步骤：

1)取待测的鸭茅亚种幼嫩叶片提取基因组DNA；

2)以步骤1)中所得的基因组DNA为模板，采用如权利要求1中所述的4对cpSSR标记引物进行PCR扩增；

3)将步骤2)中扩增所得的产物通过电泳进行多态性检测，对清晰的条带进行统计；

4)根据步骤3)所得的统计数据构建种质群体结构图，即获得鸭茅亚种群体结构和物种鉴定的结果。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的PCR扩增，其PCR扩增体系为10μL：包含1μL的模板DNA，0.5μL的5pmolμL^-1的上下游引物，5μL的2×TaqPCR MasterMixII，3μL的ddH₂O；其PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸35s，共35个循环；72℃延伸5min，于4℃保存。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的电泳，其电泳缓冲液为1×TBE，电泳仪参数为200V稳压20min，280V稳压4h。