[发明专利]一种高产白藜芦醇的酵母基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供一种高产白藜芦醇的酵母基因工程菌及其构建方法和应用，该工程菌通过在酿酒酵母染色体上过表达白藜芦醇合成酶STS、对香豆酰基辅酶A连接酶4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶TAL、肉桂酸‑4‑羟化酶C4H、细胞色素P450酶还原酶CPR、DAHP合成酶突变体ARO4、分支酸变位酶突变体ARO7、分支酸合酶ARO2、莽草酸激酶AroL、乙酰辅酶A合成酶ACS和丙二酰辅酶A合成酶ACC1，同时敲除旁路基因CIT2、LPP1、DPP1、PDC6，实现以葡萄糖为底物生物合成白藜芦醇。本发明利用苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶同时以苯丙氨酸和酪氨酸作为底物反应生成白藜芦醇合成的关键前体，强化白藜芦醇合成所需要的前体，使产物白藜芦醇的产量得到了大幅度的提高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种高产白藜芦醇的酵母基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

白藜芦醇（3,4',5-三羟基二苯乙烯）是一种天然活性物质，是植物体在恶劣环境下或遇到病原体侵害时自身分泌的一种抗毒素，广泛存在于花生、葡萄、虎杖和决明子等天然植物中。近年来的研究表明，白藜芦醇具有抗氧化、抗肿瘤、抗自由基、保护肝脏、保护心血管、调节免疫、抗病毒、抗细菌及真菌、抗变态反应、辐射保护、预防急性传染性非典型肺炎等功效，可广泛应用于医药、食品、化妆品和保健品等领域，是很有潜力的天然化合物。

目前白藜芦醇产品根据生产方式分为三种类型，包括植物提取、合成和发酵，每一种类型都有对应的应用行业，包括膳食补充剂、化妆品、食品和饮料等。目前白藜芦醇最主要的生产方法是植物提取法，国外主要是从葡萄皮和葡萄籽中提取，而我国主要从中药材虎杖的根部提取，在市场中占据主导地位。然而白藜芦醇在植物组织中的含量并不高，提取工艺复杂且提取效率低，需要消耗大量的原材料，虎杖的价格较为昂贵，生长周期较长、容易受到气候变化的影响，使得其生产成本和可控性都受到了一定影响。化学合成法合成的白藜芦醇与天然提取的白藜芦醇具有相同的生物活性，能快速大量生产白藜芦醇，满足市场需求，但化学合成法存在合成路线长、生产成本较高、环境污染严重等问题，需要探寻生产成本低且绿色环保的新方法。鉴于植物提取和化学合成各自的缺陷，寻找高产量、低能耗及减少牺牲环境为代价的生物合成方法，尤其是具有易于发酵生产，生产周期短，生产成本低，产物提纯简便，环境污染少等优势的微生物合成法受到了研究者的青睐。近年来，随着微生物代谢工程与合成生物学技术的进步，在微生物中设计与构建高效的异源合成途径，结合工程菌株的大规模发酵是实现白藜芦醇等植物源天然产物工业化生产的重要方法。

近年来基于微生物细胞工厂生产白藜芦醇的研究取得了诸多进展，如在大肠杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、谷氨酸棒状杆菌等宿主菌中已实现白藜芦醇的异源发酵合成，但仍存在一些亟需解决的问题。值得注意的是，在解除了反馈抑制的前提下，增加解脂耶氏酵母中白藜芦醇异源合成途径的拷贝数，获得了较高的白藜芦醇产量（Sáez-Sáez J,Wang G, Marella E R, et al, Engineering the oleaginous yeast Yarrowialipolytica for high-level resveratrol production[J], Metabolic Engineering,2020, 62: 51-61。但是相比酿酒酵母等模式微生物，对解脂耶氏酵母的系统性研究仍较为有限，不利于进行系统性的代谢途径优化，将限制其对进一步提高白藜芦醇等化合物的发酵产量。