[发明专利]一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的特异性引物、探针和方法

说明书

本发明属于中药鉴别技术领域，尤其涉及一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的特异性引物、探针和方法。本发明所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为5'‑CATCCCGTTAGTGGGTAGC‑3'，所述下游引物的核苷酸序列为5'‑CCTAGTGGCTTCGGGCG‑3'；所述探针的核苷酸序列为FAM‑TAGCGGCGTCATTCCAAAATACAAC‑BHQ1'。所述方法利用所述的上游引物和下游引物和探针进行当归和欧当归的鉴别。本发明可以根据荧光扩增曲线作为判定当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的依据。

技术领域

本发明属于重要鉴别方法技术领域，尤其涉及一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的特异性引物、探针和方法。

背景技术

人参健脾丸包括大蜜丸、小蜜丸和水蜜丸3种规格，处方组成一致，均由人参、白术、茯苓、当归等十一味药组成，具有健脾益气、和胃止泻的功效。处方中当归为伞形科植物当归Angelica sinensis的干燥根，具有补血活血，调经止痛，润肠通便的功效。

欧当归为伞形科植物欧当归Levisticum officinale的干燥根，具有通经止痛、发汗利尿的功效。两者在植物基原和外观性状上相近，但功效则有显著差异，故不能混用。由于欧当归易于栽培、生长期短、产量大，价格相对便宜，因此在药材市场上存在当归中掺杂混用欧当归的情况，给人民群众的用药安全带来了不确定的风险因素。

传统中药鉴别主要依靠性状、显微和理化方法，但这些传统技术往往受制于人员专业知识和从业经验，具有一定的局限性。且当归与欧当归外观性状和化学物质基础相近，特别是在加工成饮片，或作为原料药材投入到中成药制剂生产后，给两者的鉴别带来了更大的困难。

随着DNA分子生物学技术的不断发展和广泛应用，弥补了中药传统鉴别方法的不足。因此，研究出一种能在DNA层面鉴别当归及其制剂中是否混有欧当归的方法具有重要的研究意义和应用意义。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鉴别当归及其制剂中是否混有欧当归的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明在DNA层面鉴别当归和欧当归，应用到中药及其制剂的分子生物学方法主要为DNA条形码和PCR方法。PCR方法包括聚合酶链式反应和实时荧光PCR，聚合酶链式反应(PCR)是2020年版《中国药典》鉴别药材及其伪品常用分子生物学方法，实时荧光PCR方法较聚合酶链式反应法有更高特异性、灵敏度、稳定性好，不受外界环境干扰，从物种DNA层面进行鉴别，准确度更高；无需大型试验仪器，成本低，更是首次应用到当归及欧当归的鉴别中，是未来中药鉴别发展的方向。

一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为5’-CATCCCGTTAGTGGGTAGC-3'，所述下游引物的核苷酸序列为5'-CCTAGTGGCTTCGGGCG-3'。

一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的探针，所述探针5'端标记荧光素基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1，所述探针的核苷酸序列为FAM-TAGCGGCGTCATTCCAAAATACAAC-BHQ1'。

一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的方法，所述方法利用所述的特异性引物和所述的探针进行当归和欧当归的鉴别，所述方法包括：

结合所述的特异性引物和所述的探针进行实时荧光PCR反应，检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有欧当归；

结合所述的特异性引物和所述的探针进行实时荧光PCR反应，检测或辅助检测待测样品是否为或候选为欧当归。

所述方法的主要步骤包括：

(1)提取待测样品的总DNA；