[发明专利]一种果糖基转移酶及其编码基因

说明书

本发明涉及酶工程领域，具体的说就是果糖基转移酶及其编码基因，该酶对高温、强酸、强碱和有机溶剂有很高耐受性，催化菊糖产生双果糖苷III。现有已经表征的果糖基转移酶数量较少，活性不高，而且在高温、强酸、强碱及有机溶剂存在等特殊环境下活性很低，甚至完全失活，从而影响到酶的应用范围。本发明提供一个可以在大肠杆菌中高效表达的果糖基转移酶基因，不仅活性高，而且对高温、强酸、强碱及有机溶剂有较高的耐受性，展现出良好的生产应用前景。

技术领域

本发明涉及酶工程领域，本发明涉及酶工程领域，具体的说就是一种对高温、强酸、强碱和有机溶剂有很高耐受性，催化菊糖产生DFA III的果糖基转移酶及其编码基因。

背景技术

DFA III(又名双果糖苷III)是一种自然界存在的双糖，作为一种重要的功能性食品，具有良好的理化性质。该糖的甜度和能量分别是蔗糖的1/2和1/15，作为蔗糖的替代品，摄入该糖以后胰岛素和血糖水平不增高，所以更有利于糖尿病、肥胖病等特殊人群。而且该糖不能被突变链球菌利用，因此在口腔中残留时不会引起pH的明显降低，因此长期摄入该糖引发龋齿的可能性比摄入远低于摄入蔗糖(赵萌等.食品与发酵工业.2008,(08):123-126)。该糖还能促进Ca、Fe、Mg等矿质元素的吸收，增加骨骼的生长(Afsana K.etal.2003.J.Nutr,133:3553-3560)。同时，该糖还能促进乳杆菌、双歧杆菌等肠道益生菌的生长，而且有利于改善便秘、排尿(重松典宏等.日本专利，200810182836.2)。另外，该糖对热和酸非常稳定，不易发生美拉德反应，有利于食品加工处理。因此，该糖在食品和医药等多个领域都具有广阔的应用前景。

DFA III的合成方法分为化学合成和酶法合成两类。其中酶法合成因其不产生同分异构体、分离纯化简单、不污染环境而成为首选策略。DFA III主要通过果糖基转移酶以菊糖为底物生成。1972年Tanaka等人首次发现微生物发酵过程中，能生成一种可降解菊糖生成DFA III的糖基转移酶(Tanaka K.et al.1972.Biochemimica et Biophysica Acta,284:248-256)。产DFA III型果糖基转移酶(EC 4.2.2.18)在很多种微生物中被发现并表征，而不同来源的果糖基转移酶的分子量一般在40kDa到150kDa之间，最适pH一般在5.0-6.0之间，多为二聚体，个别酶为三聚体。催化过程中，果糖基转移酶在菊糖存在下，从底物的非还原果糖基末端依次脱下两个果糖基单位，并同时催化分子内果糖基转移反应，使脱落的果糖基之间生成β(3→2)糖苷键，从而形成DFA III。已知的果糖基转移酶在活性、稳定性等方面仍有待进一步提高。目前国际上DFA III相关研究主要集中在日韩，而且日本的一家公司已实现了DFA III的工业化生产，而国内相关研究较少(Zhang W.et al.BiotechnolAdv.2017；35(2):267-274)。目前仅有少数几个果糖基转移酶已实现大肠杆菌胞内异源表达和功能验证。因此，克隆并表征更多新的果糖基转移酶，特别是活性高、稳定性好的果糖基转移酶，将有利于该酶的实际应用，为DFA III的工业化生产奠定基础。本发明基于生物信息学分析，设计简并引物，以富集土壤中的宏基因组DNA为模板，扩增果糖基转移酶基因，克隆到表达载体，并在大肠杆菌中表达，表明该酶是一种对高温、强酸、强碱和有机溶剂有很高耐受性，能催化菊糖产生DFA III的果糖基转移酶。

发明内容

本发明目的是提供一种对高温、强酸、强碱和有机溶剂有很高耐受性，能催化菊糖产生DFA III的果糖基转移酶及其编码基因。

从沈阳市植物园的阔叶林下取土壤，加入菊糖进行土壤微生物富集，然后从中提取宏基因组DNA，采用简并引物以上述宏基因组DNA为模板PCR扩增目的大小的DNA片段，将这些片段克隆到表达载体中，通过诱导表达，功能验证和DNA序列分析等步骤，鉴定得到一种对高温、强酸、强碱和有机溶剂有很高耐受性，能催化菊糖产生DFA III的果糖基转移酶及其编码基因。具体的研究方案为：