[发明专利]一种无抗生素介入的细菌表达系统的构建方法及应用

说明书

本发明提供了一种无抗生素介入的细菌表达系统的构建方法及应用，涉及原核表达技术领域。本发明提供了以减毒铜绿假单胞菌PAK‑JΔ6菌株为基础菌，删除嘌呤合成关键基因purEK，获得腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK‑JΔ6(Ade)。本发明通过引入携带purEK操纵子的质粒pExoS₅₄(Ade)回补PAK‑JΔ6(Ade)背景菌株的营养缺陷，使其可在无嘌呤的培养基中生长。本发明利用purEK操纵子替换掉质粒上原有的氨苄青霉素抗性(Amp^R)基因盒，利用腺嘌呤营养限制作为pExoS₅₄(Ade)质粒的维持压力，从而避免了抗生素的使用。

技术领域

本发明属于原核表达技术领域，具体涉及一种无抗生素介入的细菌表达系统的构建方法及应用。

背景技术

在遗传工程领域，准确控制基因的表达对于研究基因的功能以及生命体的生命活动均具有非常重要的意义。相对于真核细胞复杂的基因表达系统，原核细菌的基因表达系统则简单很多，因此常见多种细菌表达系统。细菌表达载体通常需要添加抗生素来保证表达载体的稳定存在，抗生素的引入会导致细菌发酵的成本的增加，不便于大规模的制备；若将基因整合到基因组上表达，虽然不再需要引入抗生素，但由于拷贝数低，限制了基因的大量的表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无抗生素介入的细菌表达系统的构建方法及应用，在质粒上引入其他筛选压力来替换抗生素的筛选，从而避免发酵过程中抗生素的使用，降低细菌大规模发酵的制备成本。

本发明还提供了一种腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)的构建方法，包括以下步骤：删除减毒铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAK-JΔ6菌株的基因组中参与从头合成嘌呤核苷酸的磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK，获得腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)；所述PAK-JΔ6菌株已完成保藏，保藏编号为CGMCCNo.24851。

优选的，所述参与从头合成嘌呤核苷酸的磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK的核苷酸序列的GenBank gene ID：AAG08810.1-AAG08811.1。

本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)。

本发明还提供了一种无抗生素介入细菌表达载体的构建方法，包括以下步骤：将大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭载体pExoS₅₄中的氨苄青霉素抗性基因盒替换为磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK的操纵子；

所述磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK的操纵子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述氨苄青霉素抗性基因盒的核苷酸序列GenBank:AAB40011.1。

本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的无抗生素介入细菌表达载体pExoS₅₄(Ade)。

本发明还提供了一种无抗生素介入的细菌表达系统的构建方法，包括以下步骤：将目标蛋白的编码基因克隆到上述无抗生素介入细菌表达载体pExoS₅₄(Ade)中，得到目标蛋白表达载体；

将所述目标蛋白表达载体转化入上述腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)中，获得铜绿假单胞菌外源蛋白表达系统。

优选的，所述目标蛋白包括转录因子、酶、疫苗抗原、结构蛋白、纳米抗体或毒力因子。

本发明还提供了利用上述构建方法得到的无抗生素介入的细菌表达系统。

本发明还提供了上述无抗生素介入的细菌表达系统在干细胞定向分化、细胞重编程、细胞基因编辑、蛋白质功能、疫苗开发或抗肿瘤制剂的制备中的应用。