[发明专利]一种高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌及其应用

说明书

本发明公开了一种高效表达生淀粉α‑淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌及其应用。本发明枯草芽孢杆菌重组菌以pBHSS142为表达载体、以来源于Pontibacillussp.ZY的生淀粉α‑淀粉酶基因为目的基因、以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600为表达宿主，在目的基因的上游插入了信号肽基因，改造了启动子、5'非翻译区序列和近端编码序列。利用本发明枯草芽孢杆菌重组菌可高效表达α‑淀粉酶，以其为生产菌株，摇瓶发酵48h，可将发酵液中α‑淀粉酶的酶活提高至2974U/mL。

技术领域

本发明涉及一种高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

α-淀粉酶(α-amylase，EC 3.2.1.1)是糖苷水解酶类中一类重要的工业用酶，其来源广泛，在动物、植物和微生物均有分布。α-淀粉酶作用于淀粉、多糖及寡糖内部的α-1,4-葡萄糖苷键，产生α-异头物构型保留的低聚麦芽糖和葡糖糖。因此α-淀粉酶被广泛应用于食品加工、污水处理、制药工业、酿酒工业、新型生物能源应用方面。

在已发现的α-淀粉酶中，只有不足10％的酶具有降解生淀粉的能力。此类酶直接作用不经糊化的生淀粉，可有效的简化现代发酵工业中的生淀粉的前期处理过程，降低能量和成本。截止目前，多数生淀粉α-淀粉酶已经被克隆并异源表达，主要的表达宿主为大肠杆菌和芽孢杆菌。然而，目前生淀粉α-淀粉酶的表达水平仍然较低，除了缺乏高比酶活的生淀粉α-淀粉酶之外，高效的蛋白表达菌株仍是一个重要的限制因素。枯草芽孢杆菌已经被报道用来表达多种淀粉酶，相对于大肠杆菌而言，其不含有内毒素，是一种食品安全菌株，同时也可以将目的蛋白分泌至胞外，有利于后续蛋白的处理。生淀粉也被称为颗粒状淀粉，无需烹饪、低温、亚糊化温度或非常规淀粉水解被认为是淀粉加工行业的重大突破，因此，开发具有能够高效表达生淀粉α-淀粉酶的重组菌株表现出更大的应用前景。

发明内容

为了解决上述生淀粉酶生产中的问题，本发明提供了一种高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌及其应用一种高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌及其应用。利用本发明的枯草芽孢杆菌工程菌可高效表达α-淀粉酶，以其为生产菌株，摇瓶发酵48h，可将发酵液中α-淀粉酶的酶活提高至2974U/mL。

本发明高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌，分类命名为Bacillussubtilis WB600/pBHSS142-C1-amyZ1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国·武汉·武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022980，保藏日期为2022年6月27日。

本发明高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌，由重组质粒和表达宿主组成。所述重组质粒由目的基因、启动子序列、5'非翻译区、信号肽基因以及表达载体组成；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600。

进一步地，所述目的基因为α-淀粉酶基因；所述α-淀粉酶基因AmyZ1的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，或为SEQ ID No：1经同义突变几个核苷酸且编码相同蛋白质氨基酸序列的核苷酸序列。

进一步地，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述5'非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述信号肽基因同义突变的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述表达载体为pHT43或以pHT43为基础构建获得的pBHE或pBHSS142。

本发明高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌，优选以pBHSS142为表达载体、以来源于Pontibacillus sp.ZY的生淀粉α-淀粉酶基因为目的基因、以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600为表达宿主，在目的基因的上游插入信号肽基因，改造了启动子、5'非翻译区序列和近端编码序列。

本发明高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌的构建方法，包括如下步骤：