[发明专利]一种赭曲霉毒素A的快速检测方法及试剂盒

说明书

一种赭曲霉毒素A的快速检测方法及试剂盒。灵敏度是评价传感器分析性能的重要参数之一。我们利用Mg²⁺依赖性DNA酶(MNAzyme)及熵驱动催化反应两种核酸放大技术，构建一种高灵敏度的新型传感器用于检测OTA。OTA存在时，释放出的引发链DNA1和互补链DNA2配对形成MNAzyme，在Mg²⁺的作用下，催化裂解修饰有rA位点DNA底物H1，裂解产生单链DNA3打开发夹H2后循环催化裂解DNA底物H1，裂解产生的单链DNA4进入熵驱动催化反应循环，通过链置换反应释放出富G序列，与氯化血红素(hemin)结合形成hemin/G四链体DNA酶催化生色底物产生颜色信号。本方法利用hemin/G四链体DNA酶代替生物酶大大降低检测成本，级联信号放大技术也极大地提高该方法的灵敏度，检出限达到48.97fM。

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种赭曲霉毒素A检测方法及试剂盒。

背景技术

赭曲霉毒素A(OTA)污染广泛存在于谷物(如玉米、小麦、大麦、燕麦和小米)和谷物衍生产品(如面粉、面包、啤酒和伏特加)中，造成严重的食物安全问题。赭曲霉毒素A污染也存在于农场动物饲料中，对牲畜家禽生产构成潜在威胁。同时，赭曲霉毒素A可以通过食物链进入人体内，研究人员在人体血液、母乳和尿液中都发现它的存在，给人类健康造成严重影响。大量的动物实验表明，赭曲霉毒素A对啮齿动物具有致癌性，国际癌症研究机构(IARC)将其归为人类的潜在致癌物(2B组)。因此，对受赭曲霉毒素A污染的食品和饲料进行筛查对于保证人体健康具有重要的意义，而这有赖于发展有效、可靠的检测方法。

目前，包括高效液相色谱法、质谱法、液-质联用法及原子荧光光谱法等广泛应用于赭曲霉毒素A的检测，虽然这些方法有较好的灵敏度，但由于这些检测方法操作繁琐、成本高、重现性差，应对现场检测仍然面临困难，因此开发具有操作简单、成本低、稳定性高的赭曲霉毒素A检测方法仍然具有十分重要的意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种赭曲霉毒素A的高灵敏检测方法。为最大限度的提高检测灵敏度，本发明设计了一种目标物激活的级联信号放大反应，用于检测痕量的赭曲霉毒素A。如图1所示，当赭曲霉毒素A存在时，它与双链复合物(Apt-DNA1)上的核酸适配体(Apt)特异性结合，双链复合物解链并释放出引发链DNA1。释放的引发链DNA1和体系中的互补链DNA2配对形成裂开型Mg²⁺依赖性DNA酶(s-MNAzyme)，在Mg²⁺的参与下循环催化裂解修饰有rA位点的DNA底物H1，产生两条DNA单链(DNA3、DNA4)。新生成的DNA3与发夹探针H2结合，并释放出封闭在发夹部位的Mg²⁺依赖性DNA酶(MNAzyme)序列，形成单链型Mg²⁺依赖性DNA酶(t-MNAzyme)，也能够循环催化裂解底物H1成生单链DNA3和DNA4。同时，生成的DNA4作为触发链引发下游的熵驱动催化反应(EDC)，DNA4首先与三链复合物R-P-Q杂交，通过链置换反应将富G序列P置换出来并形成新的三链复合物(R-DNA4-Q)。然后，辅助探针F与R-DNA4-Q结合并形成F-Q双链复合物，释放出游离的R和DNA4。被释放出的DNA4继续参加下一轮熵驱动催化反应。而此前被释放出来的P是设计的富G序列，能够与氯化血红素(hemin)结合形成hemin/G四链体DNA酶，在过氧化氢(H₂O₂)存在下催化氧化2,2，-联氨-双-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二氨盐(ABTS)显色，通过肉眼观察到反应体系溶液的颜色由无色变为绿色，用紫外可见分光光度计可以发现反应体系在420nm处有最大吸收峰。随着赭曲霉毒素A浓度的增加，检测到的比色信号也逐渐增加，因此，可以实现对赭曲霉毒素A的定量检测。当目标物不存在时，引发链DNA1由于跟核酸适配体Apt杂交而不能与DNA2配对形成s-MNAzyme，使得后续反应无法发生，反应体现显现弱的背景信号。