[发明专利]检测流感病毒H5、H7、H9亚型的引物和探针及其应用、试剂和数字PCR试剂盒

说明书

本发明提供了一种检测流感病毒H5、H7、H9亚型的引物和探针及其应用、试剂和数字PCR试剂盒，涉及生物技术领域。本发明提供的检测流感病毒H5、H7、H9亚型的引物和探针，其中引物具有如SEQ ID NO.1‑6所示的核酸序列，探针具有如SEQ ID NO.7‑9所示的核酸序列，该引物和探针特异性强，灵敏度高，能够用于制备检测流感病毒H5、H7、H9亚型的产品，实现对流感病毒H5、H7、H9亚型的检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种检测流感病毒H5、H7、H9亚型的引物和探针及其应用、试剂和数字PCR试剂盒。

背景技术

流感病毒(Influenza virus)在病毒分类学上属于正粘病毒科。主要通过空气中的飞沫、易感者与感染者之间的接触或与被污染物品的接触而传播，一般秋冬季节是其高发期。流感病毒包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流感的病原体。其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，可以进一步分为H1N1、H5N1、H7N9等亚型，其中的H和N分别代表流感病毒两种表面糖蛋白。至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2和H7N9亚型。根据禽流感病毒致病性和毒力的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。高致病性禽流感目前有H5N1亚型和H7N9亚型尤为引人关注，不仅造成了人类的伤亡，同时重创了家禽养殖业。

现有流感病毒检测方法包括分子诊断和免疫诊断两大方面。分子诊断技术包括反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，环介导等温核酸扩增技术(LAMP)，核酸分子杂交，数字PCR，基因芯片等。免疫诊断技术包括酶联免疫(ELISA)，荧光免疫，化学发光，胶体金等。

数字PCR比传统的RT-PCR具有更高的灵敏度和准确性，最低能够检测出单个拷贝数的样本。通过对核酸随机分配到大量的反应单元中进行扩增反应，扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集，最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量的PCR技术。然而目前还缺少一种能够同时实现对流感病毒H5、H7、H9亚型检测且适用于微滴数字PCR的试剂盒。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种检测流感病毒H5、H7、H9亚型的引物和探针，以解决上述问题中的至少一种。

本发明的第二目的在于提供上述引物和探针在制备流感病毒H5、H7、H9亚型检测产品中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种试剂。

本发明的第四目的在于提供一种数字PCR试剂盒。

第一方面，本发明提供了一种检测流感病毒H5、H7、H9亚型的引物和探针，所述引物包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；

所述第一引物对具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核酸序列；所述第二引物对具有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核酸序列；所述第三引物对具有如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的核酸序列；

所述探针包括第一探针、第二探针和第三探针；

所述第一探针具有如SEQ ID NO.7所示的核酸序列；所述第二探针具有如SEQ IDNO.8所示的核酸序列；所述第三探针具有如SEQ ID NO.9所示的核酸序列。

作为进一步技术方案，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

作为进一步技术方案，所述荧光报告基团包括FAM、CY5或HEX；

优选地，所述荧光淬灭基团包括TAMRA、BHQ1或BHQ2。