[发明专利]一锅法单链DNA环化扩增和CRISPR/Cas介导的核酸分子检测方法

说明书

本发明公开了一种一锅法单链DNA环化扩增和CRISPR/Cas介导的核酸分子检测方法，本发明包括：单链DNA探针环化、滚环扩增、单链DNA的双探针CRISPR/Cas剪切识别及其单管一锅法检测反应。本发明主要针对环化、扩增、剪切识别不能同步进行的难题，采用一种同时衔接环化、扩增和剪切识别三步反应的OPERATOR技术，在体外单一反应管体系中对核酸分子精确、灵敏、快速检测。本发明相比传统的核酸分子检测方法，具有如下优点：适用于单链DNA、双链DNA和RNA分子的灵敏快速检测。特别是，检测RNA时不需要逆转录；直接进行一锅法检测，不需要分步反应，在核酸分子检测领域具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物学核酸分子检测领域，具体涉及一种一锅法单链DNA环化扩增和CRISPR/Cas介导的核酸分子检测方法，本发明是一种新的核酸等温扩增与靶标信号读出一体化检测技术，利用DNA连接酶、链置换DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白在常温条件下，可快速、一步法、单管完成特定DNA或者RNA的扩增和检测反应。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)进行扩增核检测反应是目前分子诊断的金标准。对于核糖核酸(RNA)的体外检测，往往需要分为两个分步骤，首先，需要将RNA样本逆转录成cDNA，然后，对cDNA样本进行常规的qPCR扩增检测分析。虽然，已经有商业化的逆转录荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)试剂盒，然而，目前RT-qPCR试剂盒参差不齐，单次测试灵敏度在45％～60％之间(Al-TawfiqMemish,2020)。此外，RT-qPCR检测需要昂贵的热循环仪、经验丰富的操作员、且对提取的RNA质量要求较高，同时，由于RT-qPCR的测试时间较长(从样本处理到结果读出，至少2-4小时)，种种因素限制了其在即时检测(Point of Care Test，POCT)中的应用。

近年来，随着核酸等温扩增技术的发展，其在核酸分子诊断中的作用越来越凸显，等温扩增技术主要利用了扩增酶在恒温中的置换性以及聚合酶特性，能够在引物的自发作用下实现对特定靶标的高效扩增。目前，已经衍生出多种核酸等温扩增方法，例如：环介导等温扩增技术(LAMP),它是一种利用4-6对引物识别靶标特异的位点，在60-65℃下，利用置换酶活性的Bst DNA聚合酶实现核酸的高效(1小时以内)扩增检测。重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术，是在恒温37-42℃条件下，模拟体内核酸复制机制，由3种关键酶或蛋白：重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶参与，协助DNA聚合酶扩增技术，整个反应一般在20-30min内获得可以检测水平的产品。基于核酸序列的扩增(NASBA)技术，由逆转录酶(RT)，T7 RNA聚合酶和RNase H以及两个寡核苷酸引物组成。能够在60分钟左右，完成对RNA的快速扩增。

然而，以上几种等温扩增技术都存在各自的不足，例如：LAMP法扩增，需要的引物较多(4-6条)，现场检测中容易产生气溶胶污染导致假阳性的结果。对突变位点的扩增几乎无法避免。RPA法的酶组分较为复杂，无法对突变位点进行检测，同时，对于RNA样本仍需要逆转录步骤。滚环扩增方法(RCA)是一种具有链置换活性DNA聚合酶(Phi29)催化的等温扩增反应，该方法仅需要一条锁式探针与靶序列杂交后连接成环状模板，采用通用型引物与环状模板匹配后在DNA聚合酶作用下沿环延伸并不断置换先前产生的延伸链，最终产生重复的长单链DNA产物，具有在30-37℃直接高效扩增的优点。但是对于扩增的单链DNA的产物的检测缺乏有效和特异性的方法。