[发明专利]一锅法单链DNA环化扩增和CRISPR/Cas介导的核酸分子检测方法

权利要求书

1.一锅法单链DNA环化扩增和CRISPR/Cas介导的核酸分子检测方法，其特征在于，所述核酸分子检测方法包括如下步骤：

(1)从检测样本中提取核酸样本；

(2)配制反应系统混合液，所述混合液包括：单链DNA探针、双荧光标记单链DNA探针、寡核苷酸引物、DNA连接酶或其变体、链置换DNA聚合酶或其变体、向导RNA或其衍生物、CRISPR相关Cas蛋白或其变体、OPERATOR反应缓冲液；其中，所述向导RNA或其衍生物包含与待检测核酸分子的靶序列相同的序列，单链DNA探针与待检测核酸分子的一条链特异性的互补，且单链DNA的骨架序列指除互补靶标部分的序列或其衍生物以外，还包括PAM位点序列和随机连接序列；

(3)将核酸样本加入反应体系混合液中，进行恒温反应；

(4)荧光探针被剪切后产生可以检测的荧光信号，读取和记录产生的荧光信号，得核酸检测结果。

2.根据权利要求1所述的核酸分子检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述核酸样本中待检测核酸分子包括单链DNA、双链DNA、单链RNA中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的核酸分子检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述单链DNA探针的5’端和3’端分别和待检核酸分子序列互补，其中所述单链DNA的骨架序列指除互补靶标部分的序列或其衍生物以外，还包括PAM位点序列和随机连接序列。

4.根据权利要求1所述的核酸分子检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述寡核苷酸引物为碱基修饰后的随机引物或与待检测核酸分子序列一致的引物。

5.根据权利要求1所述的核酸分子检测方法，其特征在于，所双荧光标记单链DNA探针的序列和待检核酸分子序列互补，探针的5’端、3’端标记有荧光基团；探针的5’端的荧光基团包括FAM、HEX、VIC、Cy5、Cy3、ROX、FITC、Joe中的一种，3’端标记的荧光淬灭基团包括TAMRA、BHQ1、MGB、BHQ2中的一种。

6.根据权利要求1所述的核酸分子检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述DNA连接酶为连接双链DNA分子或者RNA/DNA杂交双链的单链DNA缺口的连接酶；DNA连接酶包括T4 DNA连接酶、E.coli DNA连接酶、SplintR连接酶、HiFi Taq DNA ligase中的一种；所述链置换DNA聚合酶包括Phi29、Klenow、Vent中的一种。

7.根据权利要求1所述的OPERATOR等温检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述CRISPR相关Cas蛋白为具有双链DNA或单链DNA识别剪切功能和反式DNA单链剪切功能的CRISPR-Cas核酸酶；所述CRISPR-Cas核酸酶包括SpyCas9、FnCas9、FnCas12a，LbCas12、BhCas12b、Bs3Cas12b、LsCas12b、SbCas12b、AaCas12b、AkCas12、AmCas12b、BsCas12b、DiCas12b、TcCas12b、AacCas12b、LwCas13、Cas14中的一种或其变体中的一种。

8.根据权利要求1所述的核酸分子检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述向导RNA或其衍生物的间隔序列与目标核酸分子序列互补。

9.根据权利要求1所述的核酸分子检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述OPERATOR反应缓冲液包括1-5mM dNTP、10-100mM Tris-HCl、5-25mM MgCl₂、0.01-20mM ATP、0.5-10mMDTT和0.5-1.5mg/ml牛血清蛋白，所述缓冲液pH值在6.5-8.0之间。

10.一种基于权利要求1所述的核酸分子检测方法的等温核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶混合液、单链DNA探针、向导RNA、双荧光标记单链DNA探针、寡核苷酸引物和OPERATOR反应缓冲液；所述酶混合液包括CRISPR-Cas核酸酶、DNA连接酶、链置换DNA聚合酶。