[发明专利]用于扩增EGFR-T790M基因变异的blocker探针、引物组及其应用

说明书

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及用于扩增EGFR‑T790M基因变异的blocker探针、引物组及其应用。本发明提供的blocker探针长度小于20nts，同时突变位点两侧1或2nts范围内的锁核酸修饰又能够保证其与野生型模板结合的热稳定性。此外，本发明还提供了用于扩增EGFR‑T790M基因变异的引物组，该引物组包含上述blocker探针，同时还包括与该blocker探针搭配使用的两条上游引物，两条上游引物的设置能够避免SNP位点rs1050171存在G＞A突变时，假阴性结果的出现。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及用于扩增EGFR-T790M基因变异的blocker探针、引物组及其应用。

背景技术

目前在qPCR平台上，对肿瘤突变位点检测常用方法为突变扩增系统(amplification refractory mutation system, ARMS)法，本方法的上游引物和blocker为竞争性结合关系，利用引物/blocker与模板间的Tm值差使blocker和野生型模板优先结合，引物优先与突变型结合，阻断野生型扩增，不阻断突变型扩增，从而达到富集突变型模板的效果。

基于此，申请人于2019年5月21日提交中国专利局、申请号为CN2019104222174、发明名称为“一种用于扩增变异型靶基因片段的非淬灭型寡核苷酸探针及其应用”的中国发明专利申请以及其多件同族发明申请中提供了用于EGFR-T790M基因突变型选择性扩增的blocker探针。

然而，在后续使用过程中，申请人发现，（1）由于上述blocker探针过长，使得其在qPCR反应体系中表现较差，对突变型也有明显抑制，无法达到较好效果；（2）T790M位点前存在高频SNP位点rs1050171（GA），在19.6%的亚洲人中，rs1050171位点是A（GA），rs1050171的突变状态会影响基于ARMS的EGFR-T790M检测系统的灵敏度，从而产生假阴性或假阳性的结果。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于，在申请人现有EGFR-T790M基因变异的blocker探针基础上，对blocker探针进一步改进，得到迭代的blocker探针和扩增引物组，以进一步提高低频率基因变异的检测灵敏，同时期望该blocker探针能够在qPCR条件下取得不逊于数字PCR或高通量测序的检测效果，从而取得操作简单、成本低、性价比高的优势。

为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供用于扩增EGFR-T790M基因变异的blocker探针，（1）所述blocker探针的核苷酸序列覆盖EGFR-T790M基因突变位点，与野生型EGFR-T790M基因片段完全匹配，与突变型EGFR-T790M基因片段在突变位点错配；（2）所述blocker探针核苷酸序列长度小于20nts，其中突变位点及两侧1或2nts范围内对应碱基经过锁核酸修饰。

在可选的实施方式中，所述blocker探针的核苷酸序列从5’端到3’端为（X_m）CACGC（X_n）或与其严格杂交的互补序列，所述X_m为突变位点上游m个与野生型EGFR-T790M基因片段完全匹配核苷酸，所述X_n为突变位点下游n个与野生型EGFR-T790M基因片段完全匹配核苷酸，所述m+n＜15，所述blocker探针中斜体并字体加粗标出的核苷酸对应突变位点，下划线表示该核苷酸经过锁核酸修饰，所述突变位点上游的CA和突变位点下游的GC中至少有一个核苷酸经过锁核酸修饰。

在可选的实施方式中，所述m≤6。