[发明专利]一种校正海洋微生物样本核酸提取损失的方法

说明书

本发明公开了一种校正海洋微生物样本核酸提取损失的方法，包括以下步骤：(1)利用淡水藻类的基因组DNA作为标准品；(2)在淡水藻类的rDNA上设计一对特异性引物和一条探针；(3)计算所设计的引物与探针的扩增效率；(4)计算该标准品与海洋微生物共提取过程中的基因组DNA提取效率，从而通过基因组DNA提取效率，校正海洋微生物样本在核酸提取过程中的基因组DNA的损失。本发明通过利用所设计的淡水藻类特异性rDNA引物和探针，建立校正体系，可实现方便、快捷及准确地计算海洋微生物样本在核酸制备过程中的损失；对海洋有害微生物的准确评估、精准预报以及合理的管理决策制定具有重大的推动作用，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学方法定量分析环境微生物的分析技术领域，尤其涉及一种校正海洋微生物样本核酸提取损失的方法。

背景技术

对海洋环境中的微生物(有害藻华、病原微生物)的准确的定量监测和评估一直以来都是监管部门和研究者们的非常关注的重要课题。实时定量聚合酶链式反应(qPCR)方法彻底改变了对环境微生物的监测，qPCR方法目前已经逐渐取代传统的显微镜和流式细胞术，应用于环境有害微生物的定量监测与评估。该方法由于其高灵敏度和特异性，能对传统方法难以鉴定许多环境微生物进行准确识别与定量分析。

qPCR方法能与海洋环境微生物样本的核酸靶点产生特异性的可定量数据。这些数据对于微生物群落的相互作用和过程的描述、海洋环境中的有害微生物的污染程度(水、空气)的评估、有害藻华的监测与预警、干预措施的制定(藻华消杀、海滩娱乐场所病原微生物的消毒与传染病传播的遏制)至关重要。然而，要实现以上目的，需要这些为监管部门和研究者所提供的qPCR监测数据是准确无误的。

由于基于qPCR定量的环境微生物样本在其核酸制备过程中会存在基因拷贝数的损失，比如液体转移时的残留、操作不慎导致液体的损失等等，都会造成核酸制备时微生物样本基因拷贝数的损失，从而导致对环境微生物的定量监测与评估不够准确，使得监管部门和研究者无法做出准确的判断以及有效的风险控制方案。因此，开发一种能够校正海洋环境微生物样本核酸损失的方法很有必要。

现有文献报道可以使用重组质粒标准品去校正样本在核酸提取过程中基因的损失。该方法如果对海水样本没有产生特异性的扩增信号，经过验证后在一定程度上是可以实现对海洋环境微生物样本核酸提取损失的评估，但使用重组质粒的方法可能在实际操作过程中比较繁琐，因为需要使用载体构建重组质粒标准品，此外在基因损失的计算过程中需要用到所构建的重组质粒标准曲线。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种便捷、有效的海洋微生物样本核酸提取损失的计算与校正方法，为海洋环境有害微生物的准确定量评估、精准的预报提供有效的技术支持。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种校正海洋微生物样本核酸提取损失的方法，包括以下步骤：

(1)利用淡水藻类的基因组DNA作为标准品；

(2)在淡水藻类的rDNA上设计一对特异性引物和一条探针；

(3)计算所设计的引物与探针的扩增效率；

(4)计算该标准品与海洋微生物共提取过程中的基因组DNA提取效率，从而通过基因组DNA提取效率，校正该微生物样本在核酸提取过程中的基因组DNA的损失；

核酸损失率＝1–提取效率