[发明专利]基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病Pax-5a基因检测试剂盒及其使用方法

说明书

本发明属于生物分析领域，涉及基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病基因Pax‑5a基因检测试剂盒。在目标基因存在的时候，HP‑HCR的尾部序列与Pax‑5a基因形成平末端。加入λ核酸外切酶后，从5’端开始逐渐消化发夹，将Pax‑5a序列从HP‑HCR上释放出来与下一个发夹探针结合，实现基因的循环利用，达到第一步扩增的目的。同时，HP‑HCR被裂解成单链触发链，引发杂交链式反应。H1链被触发链打开后，与H2链序列杂交。产生的杂交链继续与新的H1和H2链结合，H1和H2上的荧光基团与猝灭基团相互远离，荧光信号恢复以实现Pax‑5a基因的第二次扩增。从而实现对急性白血病Pax‑5a基因的检测。

技术领域

本发明属于生物分析领域，涉及基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病Pax-5a基因检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

急性B淋巴细胞白血病是一种可怕的癌症，尤其是在儿童中。急性白血病的主要特征表现为细胞分化和增殖的遗传变化或染色体异常。Pax-5通常是指Pax-5a，Pax-5基因在调节B细胞的发育和分化中起重要作用，是Pax家族的成员中的一员。Pax-5基因的异常表达与淋巴细胞白血病密切相关。它在其他谱系的肿瘤中很少呈阳性，因此Pax-5被认为是B细胞谱系的标志物。因此，研究和检测Pax-5基因对于急性B淋巴细胞白血病的早期诊断和晚期治疗具有重要意义。

λ核酸外切酶是一种外切酶，可以消化磷酸化的双链DNA和单链DNA。反应机理是沿5’-3’序列逐渐降解磷酸化的单核苷酸5’端。λ核酸外切酶具有高剪切速率，但对非磷酸化DNA和单链DNA的活性较低。鉴于此特性，λ核酸外切酶可用于切割磷酸化双链DNA以获得所需的单链DNA。

为了提高检测核酸时信号的灵敏度，往往需要构建信号放大系统。研究人员提出了许多用于放大生物信号的技术，例如CRISPR-Cas13a放大系统、解旋酶连接的放大系统、聚合酶链式反应(PCR)和杂交链式反应(HCR)。本课题组前期对急性白血病基因Pax5a检测采用了电化学法对信号进行放大，通过DNA聚合酶和限制性内切酶两种酶的相互协同作用，实现了目标基因的循 环利用，放大了检测信号；酶促扩增产生的G-四链体可以与hemin结合形成具有辣根过氧化 物模拟酶性质的G-四链体/hemin复合物，利用其催化双氧水的还原产生的稳定的电流信 号，实现了对目标基因的灵敏检测；然而，电化学生物传感器通常在信号产生方面具有某些限制。一方面，在构建电化 学生物传感器时，需要标记适当的电活性物质，这可能会限制检测灵敏度；第二方面，一般 电化学层层组装反应会在电极表面不断引入干扰物；第三方面，直接在电极界面将适当的 信号放大技术引入电化学生物传感器的构建是存在效率问题。因此，在电极表面上开发新 型信号放大策略、抗干扰及信号放大效率等以提高分析物检测灵敏度为指标方法对于扩大 电化学分析应用和性能具有重要意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出一种基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病Pax-5a基因检测试剂盒及其使用方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病Pax-5a基因检测试剂盒，包括HP-HCR链、H1链、H2链、缓冲液体系和λ核酸外切酶。

所述HP-HCR链序列为5’-ACTGAGTCTCCCCATGCCTGAGAGATGCGGTGATCCTTGAGACTTCAGATCTCAAGGATCACCGCATCTCTCA-3’、H1链序列为5’-TGAGAGATGCGGT-FAM-GATCCTTGAGACTAAGTTCTCAAGGAT-BHQ-CACCGCAT-3’、H2链为5’-TCTCAAGGAT-FAM-CACCGCATCTCTCAATGCGGT-BHQ-GATCCTTGAGAACTTAG-3’。