[发明专利]一种综合系统评价外泌体质量的方法

说明书

本发明提供了一种综合系统评价外泌体质量的方法，使用超滤法结合沉淀法从HepG2细胞培养上清中提取外泌体，向其分别添加不同浓度海藻糖，将各实验组放入‑80℃冻融5次。通过马尔文粒径仪测量外泌体直径，采用透射电镜观察其形态结构；使用BCA法检测蛋白质浓度，检测其生物标记蛋白质HSP70、TSG101、CD63的变化；使用液相色谱‑质谱联用仪检测外泌体上清中脂质组的含量，马尔文粒径仪测量外泌体膜Zeta电位；采用qPCR检测外泌体刺激巨噬细胞48h TNF‑α的相对表达量。通过上指标建立海藻糖对外泌体影响的评价体系，综合评价海藻糖对外泌体冻融过程中的作用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种综合系统评价外泌体质量的方法。

背景技术

外泌体具有磷脂双分子层囊泡结构，内含DNA、RNA、蛋白质、脂质等多种生物大分子，直径大小在30-150nm之间，在细胞间的信息传递过程中发挥重要作用，广泛参与机体损伤组织修复、基因交换、抗原呈递免疫反应、肿瘤转移等生理病理过程；外泌体可通过配体-受体相互作用的方式粘附到受体细胞表面，亦可通过受体细胞内吞摄取或通过囊泡和细胞膜的直接融合使外泌体内容物释放到靶细胞内，发挥细胞间的通讯作用，从而调节靶细胞的生物学行为；与细胞相比，细胞分泌的外泌体更稳定，更安全，保存更方便，质量更好控制。

目前评价外泌体质量的方法并不统一，有文献使用透射电镜加外泌体生物标记物，有些文献评价外泌体的质量是通过粒径分析，外加蛋白生物标记物。使得外泌体质量评价方法杂乱无章，缺少统一化，系统化的评价方法，已有研究表明海藻糖对外泌体具有保护作用。

因此，有必要建立全面评价外泌体质量的评价方法，为研究外泌体的科研人员提供可参考的评价外泌体质量的方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种综合系统评价外泌体质量的方法。

为了达到上述目的，本发明的实施例提供了一种综合系统评价外泌体质量的方法，通过对外泌体的形态学的检测，脂质膜结构，蛋白质，生物功能学四个方面进行全面的检测，综合评价外泌体的质量情况；具体步骤如下：使用超滤法结合沉淀法从HepG2细胞培养上清中提取外泌体，向外泌体中分别添加不同浓度海藻糖，分为Fresh组、10％DMSO组(阳性对照)、PBS组(阴性对照)、5mM组、25mM组、125mM组，将各实验组放入-80℃冻融5次(Fresh组除外)。通过马尔文粒径仪测量外泌体直径，采用透射电镜观察其形态结构；使用BCA法检测蛋白质浓度，通过Western blot检测其生物标记蛋白质HSP70、TSG101、CD63的变化；使用液相色谱-质谱联用仪检测外泌体上清中脂质组的含量，马尔文粒径仪测量外泌体膜Zeta电位；采用qPCR检测外泌体刺激巨噬细胞48h TNF-α的相对表达量。通过上指标建立海藻糖对外泌体影响的评价体系，综合评价海藻糖对外泌体冻融过程中的作用。

结果：(1)形态学：通过粒径分析对比各实验组外泌体平均直径大小，发现PBS组与阳性对照10％DMSO组相比，平均粒径显著增大(**P＜0.01)；5mM海藻糖组与阳性对照组对比，粒径无显著性差异；25mM组、125mM组与阳性对照10％DMSO组对比，平均粒径显著减小(**P＜0.01)；透射电镜观察形态结果表明PBS组与阳性对照10％DMSO组相比，出现囊泡聚集融合、破裂。(2)膜结构：Zeta电位测量结果显示PBS组与阳性对照10％DMSO组相比，Zeta电位绝对值显著降低(**P＜0.01)；液相色谱-质谱联用仪检测结果显示PBS组外泌体上清脂质含量与其他组存在差异，脂质含量显著升高。(3)蛋白质：BCA法测量结果显示PBS组与阳性对照10％DMSO组相比，蛋白浓度出现显著性降低(**P＜0.01)。Western Blot结果显示PBS组与阳性对照组对比，生物标记物HSP70、CD63出现显著性低表达(**P＜0.01)。(4)生物功能学：qPCR结果表明5mM海藻糖组刺激巨噬细胞TNF-α的相对表达量与阳性对照之间无显著性差异，其他各组与阳性对照组相比，巨噬细胞TNF-α相对表达量均出现显著性降低(**P＜0.01)。