[发明专利]番茄ps-2基因的KASP标记开发及应用

说明书

本发明公开了番茄ps‑2基因的KASP标记开发及应用，通过番茄材料选定，番茄叶片DNA提取，使用KASP引物进行PCR扩增实现番茄ps‑2基因的KASP标记开发；并对扩增产物的检测和分析，本发明番茄ps‑2基因的KASP标记可用于番茄ps‑2雄性不育基因的分子标记辅助育种；对雄性不育材料和雄性可育材料均能够准确地进行鉴定，在番茄雄性不育植株的筛选中具有较高的实用性。

技术领域

本发明属于番茄育种技术领域，特别涉及番茄ps-2基因的KASP标记开发及应用。

背景技术

番茄味美、营养丰富且具有保健功能，在人们饮食结构中具有非常重要的地位。番茄栽培面积不断扩大，已成为各地全年供应重要的蔬菜之一。番茄杂种优势十分明显，当前番茄生产上全部使用杂交种子，但目前番茄在杂交种子生产上，大多仍然利用人工授粉进行杂交制种，不但费时、费力制种成本高，而且影响杂交种纯度。

番茄雄性不育类型都是隐性核不育，番茄雄性不育系在利用上存在一定困难，利用雄性不育系进行育种时，后代可育株与不育株发生分离。利用早期标记性状，幼苗时期根据标记性状鉴别不育株和可育株，能解决原来两用系只有在开花时，才能鉴别可育株的问题。不育系商品性状较差，所以在实际应用中需将雄性不育基因进行转育。但普通的不育系转育周期很长，要通过杂交、自交各重复多代才能转育成一个优良的雄性不育系。因此，如何在早期有效鉴定可育株与不育株，将直接影响其应用价值。

发明内容

本发明之目的在于提供番茄ps-2基因的KASP标记开发及应用，解决现有技术中的问题，对雄性不育材料和雄性可育材料均能够准确地进行鉴定，在番茄雄性不育植株的筛选中具有较高的实用性。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：番茄ps-2基因的KASP标记开发，包括：

（1）番茄材料选定：

纯合雄性不育材料MS7015和番茄材料P1059，ps-2基因定位于第4条染色体，该基因和ful基因连锁，且ps-2番茄雄性不育基因为隐性单基因；

（2）番茄叶片DNA提取：

采用CTAB法从番茄叶片中提取基因组DNA；

（3）使用KASP引物进行PCR扩增：

KASP引物包括F3引物、F4引物，F3引物的核苷酸序列为：Kps-2-wild-rfF3：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGTTAATTTATCGATACC，F4引物的核苷酸序列为：Kps-2-mut-shF4：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGTTAATTTATCGATACG，反向引物Kps-2R5：AATATTCAAATTTCTGATTCCACCA，其中Kps-2-wild-rfF3和Kps-2-mut-shF4引物中GAAGGTGACCAAGTTCATGC序列和GAAGGTCGGAGTCAACGGATT序列分别对应FAM荧光标签和HEX荧光标签序列；

将提取的DNA分别加入全裙边96孔板，配制反应体系进行PCR扩增反应。

优选的，所述反应体系为PCR反应体系：反应体系总体积10ul，其中2X KASPMaster mix：5ul，KASP Primer mix：0.14ul，模板DNA：1ul，ddH20：3.86ul；

PCR反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s；61-55℃退火延伸60s，10个循环；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环；PCR反应使用Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System进行。

优选的，包括：对扩增产物的检测和分析：使用Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System自带的软件对PCR产物进行基因分型和数据分析。

本发明还提供番茄ps-2基因的KASP标记开发的应用，用于番茄ps-2雄性不育基因的分子标记辅助育种。