[发明专利](S)-转氨酶及其应用

说明书

本申请涉及一种利用生物多酶偶联法制备L‑草铵膦的方法，其包括：在(R)‑转氨酶、(S)‑转氨酶、氨基受体和氨基供体的存在下，使D,L‑草铵膦转化为L‑草铵膦。本申请的方法能够实现高浓度D,L‑草铵膦的高效拆分来制备L‑草铵膦。

本申请是于2020年12月17日递交的、申请号为202011496575.9、发明名称为“利用生物多酶偶联法制备L-草铵膦的方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种利用生物多酶偶联法制备L-草铵膦的方法。

背景技术

草铵膦(又名双丙氨膦、草丁膦，商品名包括保试达、百速顿等，英文名为phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸)，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司开发生产。草铵膦属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用，中国农业部已发布公告说明，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用；而目前草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦，但只有L-型具有除草活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。

现有制备手性纯L-草铵膦的方法主要两种：化学法和生物法。

其中化学法包括化学拆分法和化学合成法。化学拆分法是通过手性拆分试剂拆分外化学法合成的消旋D,L-草铵膦或其衍生物，从而制得光学纯的L-草铵膦。然而该工艺存在需要使用手性拆分试剂、D-草铵膦需要消旋再利用，需要多次拆分等缺点，难以规模工业化生产。化学合成法可以以天然手性氨基酸或者不对称法合成L-草铵膦。但是该过程氨基保护与脱保护过程复杂，步骤较多，多见于实验室研究中。化学合成法还可以采用不对称催化加氢法合成L-草铵膦。但该路线所使用的催化剂价格昂贵，反应路线较长，工业化成本较高。

相比化学法能耗高、污染重、成本高等劣势，生物催化法具有反应条件温和、立体选择性高、收率高等优点，是工业化制备L-草铵膦的重要趋势。

制备L-草铵膦的方法目前大多是2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸(PPO)为底物，经氨化反应，不对称合成L-草铵膦。其中CN1349561A描述了利用筛选的天冬氨酸转氨酶(Asp-TA)，以L-天冬氨酸作为氨基供体，通过转氨作用将PPO合成L-草铵膦。该工艺使用与PPO大约等摩尔量的氨基供体，生成的草酰乙酸在水中水解成丙酮酸，可以经酶促反应去除，不存在可逆反应。然而此工艺中底物PPO转化率仅有52％，效率较低，并且反应条件苛刻(80℃)。专利CN105603015B描述了一种以L-丙氨酸为氨基供体的氨基转移酶生产L-草铵膦的方法。此工艺能够将100mM的PPO完全转化成L-草铵膦，但是为了抑制逆反应，丙氨酸投量过高，反应结束仍有300mM的L-丙氨酸存在体系中，为后续分离纯化造成困难，同时反应温度高达50℃，能耗较高，不利于生产。另外还有的方法在氨基酸脱氢酶的介导下，以无机氨为供体，将PPO还原胺化制备L-精草铵膦，例如CN106978453A，反应过程采用无机氨，转化率能够达到99％以上，然而该工艺需要额外添加辅酶再生系统，产生的副产物提高了分离纯化的难度。