[发明专利]一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株及其应用

说明书

本发明公开了一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株及其应用，属于生物工程技术领域。以模式菌株解淀粉芽孢杆菌DMS7为基础，通过游离质粒表达含有淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列的密码子优化的N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因，所述淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述密码子优化的N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本申请筛选得到适宜于GlcN生产的酶活高、转化率高、耐高温且稳定性高的具有N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶活性的脱乙酰酶，应用于工业生产中，不会被噬菌体侵蚀，且不需要提取转乙酰酶和酶解后的灭酶等纯化步骤，工艺流程简化。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株及其应用。

背景技术

氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)，又称为葡萄糖胺，其分子式为C₆H₁₃O₅N。GlcN是天然的氨基单糖，在自然界中广泛存在，其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc)是甲壳素(又称为几丁质)的结构单元。在微生物或动物来源的多糖中，GlcN通常以N-乙酰基衍生物(如甲壳素)或以3-O-α-羧乙基-D-葡萄糖胺(胞壁酸)的形式存在。在人体的软骨组织、结缔组织和细胞膜中，GlcN是代谢过程中多种生物大分子合成的中间产物。

由于GlcN逐渐被普及和广泛使用，在过去的十多年，全球GlcN的需求量在不断增加，刺激了其工业化生产的发展。目前，GlcN的工业化生产方法主要是通过酸水解反应得到，但酸水解反应往往需要较苛刻的反应条件。利用酸解法生产GlcN有两种途径：一种是利用几丁质生产GlcN，通过来源于甲壳类动物的几丁质在高温条件下的酸水解得到GlcN；另一种是利用GlcNAc生产GlcN，将微生物发酵法得到的GlcNAc进行酸水解，脱乙酰基得到GlcN。但是在酸水解的过程中需要大量的酸试剂，会产生大量的废酸，这会造成环境污染，同时也容易造成设备的损耗，并且在产品安全方面会存在潜在的问题。目前正在寻求能够应用于GlcN的工业化生产的环境友好型生产方法。从植物中提取GlcN这一生产过程需要长时间的提取和高温，并且产量过低，不适用于工业化生产。之后的研究报道了生产GlcN和GlcNAc的生物技术方法，但是在使用重组大肠杆菌发酵生产GlcN的过程中，GlcN降解速度快，并且其降解产物对宿主细胞具有抑制作用，这限制了GlcN产量的增加。且通过改造后的工程菌株的产量仍不是很高，且发酵过程中所需的葡萄糖较多，工业化成本高。虽然目前已有多种生产GlcN的环境友好型方法，但都尚未应用于GlcN的工业化大规模生产。因此，目前需要一种环境友好的，转化率高、低成本且工艺简单的GlcN生产方法来取代现有的传统酸解法脱乙酰工艺。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株；本发明所要解决的另一技术问题在于提供该解淀粉芽孢杆菌工程菌株在高产氨基葡萄糖中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株，以模式菌株解淀粉芽孢杆菌DMS7为基础，通过游离质粒表达含有淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列的密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因，所述淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列连接在N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因的N端。

进一步的，以枯草杆菌游离质粒为表达载体构建的高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株。

进一步的，本申请所用的枯草杆菌游离质粒为质粒pMA5。