[发明专利]一株高产重组蛋白的酵母基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一株高产重组蛋白的酵母基因工程菌及其制备方法，该酵母基因工程菌是对酵母出发菌株进行以下一种以上的操作后得到：敲除CBC1基因、敲除RRP6基因、弱化Ypt1p的表达、强化蛋白激酶Kin1p的表达或增加HAC1 mRNA 3’BE元件数量。本发明的酵母基因工程菌可使重组蛋白的产率提高30％以上。不同于直接过表达重组蛋白或提高重组蛋白拷贝数等传统方法，该酵母基因工程菌仅从出发菌底盘细胞自身出发，围绕UPR响应相关靶点调控而展开，针对性地解决制约蛋白分泌的首要问题，即蛋白分泌压力的产生。该酵母基因工程菌用于提高其他高经济价值蛋白产量具有较强的潜力，具备广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程及微生物技术领域，涉及一株高产重组蛋白的酵母基因工程菌及其制备方法。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)由于遗传信息清晰，操作简便，培养要求低，兼具微生物与真核生物的特点，被广泛用于重组蛋白表达生产。但由于酵母细胞在表达重组蛋白时，需经过一系列复杂的胞内代谢加工过程，包括转录、翻译、新生肽链折叠及初步糖基化等翻译后修饰、转运等，其中翻译后修饰是关键环节。当细胞能力无法匹配以上加工过程时，则会产生细胞压力，从而导致重组蛋白的产量下降。为满足日益增长的重组蛋白市场需求，需要提升酿酒酵母分泌生产重组蛋白的能力。

一般可采用基因工程的方法来提升酵母表达重组蛋白的水平。例如，通过高拷贝质粒增加重组蛋白编码拷贝数来提升重组蛋白的转录水平。但这种方法无法克服重组蛋白在后续加工过程(翻译、折叠)中的限制，且会带给细胞代谢负担。也可通过更换介导重组蛋白分泌的信号肽来增加表达量。但目前用于更换的信号肽普适性不高，对于某个重组蛋白有用的信号肽，未必能适用于其他重组蛋白。改善细胞对重组蛋白的转运能力，也能提升产量。但转运蛋白往往没有专一性，过量表达转运蛋白有时会造成转运环节紊乱，反而会降低了产量。还可以直接过量表达与蛋白折叠相关的分子伴侣，如，Kar2p，来提高重组蛋白在酵母中的表达。但蛋白的折叠需要多个分子伴侣参与，有时未必能完全解除重组蛋白的分泌限制，导致提升幅度有限，有待进一步发掘合适的改造靶点基因。综上，目前的方法及改造靶点都有待进一步完善及丰富拓展。

发明内容

本发明的目的在于提供一株高产重组蛋白的酵母基因工程菌及其制备方法，来解决现有提升酿酒酵母重组蛋白表达的改造靶点数目较少的不足。通过发掘更多有效靶点基因，并尝试通过多基因协作的动态调控的方式，来提升酿酒酵母的重组蛋白表达能力。本发明围绕着与HAC1表达相关的靶点进行调控优化，动态提升酵母细胞未折叠蛋白反应响应的灵敏性，克服了现有技术的缺陷，实现了酿酒酵母重组蛋白表达能力的大幅提升。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株酵母基因工程菌，是对酵母出发菌株进行以下一种以上的操作后得到：

1、敲除CBC1基因；

2、敲除RRP6基因；

3、弱化Ypt1p(Ypt家族的小ras GTP酶)的表达；

4、强化蛋白激酶Kin1p的表达；

5、增加HAC1 mRNA的3’BE元件数量；

优选地，所述弱化Ypt1p的表达是将YPT1的启动子替换为弱启动子，如CYC1p；

优选地，所述强化蛋白激酶Kin1p的表达，是将KIN1的启动子替换为强启动子，如TEF1p；

优选地，所述的酵母基因工程菌还强化磷酸肌醇3-激酶Vps34p的表达，将VPS34的启动子替换为强启动子，如TEF1p；

更优选地，所述的酵母基因工程菌还强化二硫键异构酶Pdi1p和内质网金属蛋白酶Ste24p的表达；

所述的酵母基因工程菌还含有重组蛋白的表达质粒；