[发明专利]一种蛋白质组学标准品及其制备方法

权利要求书

1.一种蛋白质组学标准品，其特征在于：所述标准品为从MHCC97H细胞株中提取获得的细胞全蛋白质或由MHCC97H细胞全蛋白质水解得到的多肽。

2.如权利要求1所述的蛋白质组学标准品；其特征在于：所述的蛋白质组标准品由以下方法制备而成：步骤一、培养MHCC97H细胞；步骤二、从MHCC97H细胞中提取获得总蛋白质。

3.如权利要求2所述的蛋白质组学标准品；其特征在于：所述的方法还包括步骤三；具体为：将步骤二所获得的总蛋白质进行水解获得多肽。

4.一种试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包含有权利要求1-3任一项所述的蛋白质组学标准品。

5.一种如权利要求1-3任一项所述的蛋白质组学标准品的制备方法；其特征在于包括以下步骤：

步骤一、培养MHCC97H细胞；

步骤二、从MHCC97H细胞中提取获得总蛋白质。

6.如权利要求5所述的蛋白质组学标准品的制备方法；其特征在于：步骤二的具体操作为：

1.融解SDS裂解液，混匀；取适当量的裂解液，在使用前加入PMSF，使PMSF的至最终浓度为1mM；

2.去除细胞培养液，用PBS洗一遍；

3.根据细胞数量，按每一百万细胞加入150-250微升SDS裂解液的比例加入SDS裂解液；用移液枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触；

4.将样品置于冰上裂解30min；每隔10分钟涡旋震荡15秒；

5.17000×g，4℃，离心30分钟，吸取上清液为蛋白质组学标准品；置于-80°冰箱保存。

7.如权利要求5所述的蛋白质组学标准品的制备方法；其特征在于：还包括步骤三；所述步骤三的具体操作为：将步骤二所获得的总蛋白质进行滤器辅助样品制备法酶解获得多肽；具体的为：

1、向每管200微克总蛋白质样品中加入蛋白变性剂尿素，并使尿素终浓度大于6M，此时若液体有可见沉淀,可使用超声仪处理20s，每隔5s暂停一次；

2、加入50mM的DTT，置于37℃水浴锅1h；

3、加入100mM的IAA，室温静置30min；

4、将经过还原和烷基化的蛋白质样品转移至30kDa的超滤管中，4℃，12000×g离心20min；

5、加入100μL 8M尿素，4℃，12000×g离心20min，重复此步骤一次；

6、加入100μL 50mM TEAB，4℃，12000×g离心20min，重复此步骤四次；

7、加入50μL 50mM TEAB后，再加入胰酶，其中蛋白质的量与胰酶的量的比例为30:1；

8、将超滤管置于干净套管中，用封口膜密封管口，放置37℃恒温箱中孵育12h；

9、4℃下12000×g离心20min收集肽段获得多肽形态的蛋白质组学标准品。

8.一种蛋白质组学标准品细胞株的筛选方法；其特征在于包括以下步骤：

步骤一、培养待筛选的目标细胞；具体为：使用含10％胎牛血清，1％双抗，0.5％环丙沙星的DMEM完全培养基培养细胞，细胞长至90％密度进行胰酶消化传代，连续采集8～10个代次细胞，每次分别采集8×10⁶细胞数备用；

步骤二、从所获的各代次细胞中分别提取获得总蛋白质；具体步骤为：

1.融解SDS裂解液，混匀；取适当量的裂解液，在使用前加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM；

2.去除细胞培养液，用PBS洗一遍；

3.根据细胞数量，按每一百万细胞加入150-250微升SDS裂解液的比例加入SDS裂解液；用移液枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触；

4.将样品置于冰上裂解30min；每隔10分钟涡旋震荡15秒；

5.17000×g，4℃，离心30分钟，吸取上清液为总蛋白质样品；置于-80°冰箱保存；

步骤三、将步骤二所获得的总蛋白质进行滤器辅助样品制备法酶解获得多肽；具体操作为：

1、向每管200微克总蛋白质样品中加入蛋白变性剂尿素，并使尿素终浓度大于6M，此时若液体有可见沉淀,可使用超声仪处理20s，每隔5s暂停一次；

2、加入50mM的DTT，置于37℃水浴锅1h；

3、加入100mM的IAA，室温静置30min；

4、将经过还原和烷基化的蛋白质样品转移至30kDa的超滤管中，4℃，12000×g离心20min；

5、加入100μL 8M尿素，4℃，12000×g离心20min，重复此步骤一次；

6、加入100μL 50mM TEAB，4℃，12000×g离心20min，重复此步骤四次；

7、加入50μL 50mM TEAB后，再加入胰酶，其中蛋白质的量与胰酶的量的比例为30:1；

8、将超滤管置于干净套管中，用封口膜密封管口，放置37℃恒温箱中孵育12h；

9、4℃下12000×g离心20min收集肽段获得多肽形态的蛋白质组学标准品；

步骤四、质谱鉴定；将前面所获的各个代次的多肽样品进行质谱定量鉴定；搜库分别获得各代次蛋白质组的表达量；

步骤五、蛋白质组定量稳定性评估：对同一细胞株不同代次的蛋白质组表达量进行相关性分析，获得皮尔逊相关系数；对比不同细胞株之间的相关系数，相关系数最高的细胞株选为制备蛋白质组学标准品的细胞株。