[发明专利]一种新型核酸测序系统

说明书

本发明具体涉及一种新型核酸测序系统。本发明提供的系统在提高了条形码和UMI的匹配率的同时，还可以提高DNA(例如，全长cDNA)的测序准确率，有助于在实际应用场景中获得正确的信息。本发明系统有望在一定程度上解决单细胞或空间转录组全长测序中现阶段存在的问题，具有广泛的应用场景。

技术领域

本发明属于基因测序领域，具体涉及一种新型核酸测序系统。

背景技术

随着单细胞或空间转录组测序技术的发展，结合单细胞信息可以从细胞角度探究细胞异质性及细胞间差异，结合空间位置信息则可以深入理解组织微环境和细胞间的相互作用。目前成熟的单细胞或空间转录组测序手段都是将测序分子(cDNA)两端接上区分单个细胞的条形码(CB，Cell Barcode)或区分空间信息的条形码(SB，Spatial Barcode)，以及每条cDNA都带有唯一分子标识符(UMI，Unique Molecular Identifier)，接下来再通过下一代测序技术(NGS，Next Generation Sequencing)打断cDNA后进行高通量测序获得序列信息，最终再通过CB或SB区分出单个细胞或单个空间位置的序列信息。因此，获得准确的SB(或CB)和UMI对于空间(或单细胞)转录组测序至关重要。

但NGS技术因其必须将cDNA打断的特性，无法获得序列全长信息，限制了区分同一个基因的mRNA因选择性剪接(AS，Alternative Splicing)产生的多种异构体(isoforms)，不利于mRNA转录后水平调控和转录本多态性的研究。目前高通量测序平台中，仅有作为第三代测序技术的牛津纳米孔测序技术(ONT，Oxford Nanopore Technologies)和太平洋生物科学公司(PacBio，Pacific Biosciences)开发的单分子荧光测序(SMRT，SingleMolecule Real Time Sequencing)两大测序平台可以对全长cDNA实现端到端(end-to-end)的完整测序。PacBio的Iso-Seq工作流程作为全长cDNA测序的金标准，可以在一次运行周期内产生约二十万条高质量的全长cDNA读长(reads)。而ONT目前能以一张minion芯片产出百万级别的reads数目，其强大的灵活性(flexibility)、可扩展性(scalability)和更低的成本，已经越来越受到各实验室青睐，成为全长转录组研究的首选工具。

然而，ONT测序因纳米孔读取电信号的测序原理决定了其测序准确度相对较低，错误率可达5～25％，特别是同聚物(homopolymer)和串联重复区域(tandem repeatsregion)的错误。如果需要对单细胞或空间转录组文库(library)进行全长cDNA测序，会导致CB或SB无法被准确拆解，能正确识别的单细胞或空间位置的reads很少。

为解决这一问题，Volden等最早于2018年提出R2C2方法(Rolling CircleAmplification to Concatemeric Consensus)，即通过重组一段200bp的无关序列环化cDNA后利用滚环扩增(RCA，Rolling Circle Amplification)生成一条长的串联重复序列(concatemer)并进行ONT测序，后将被多次测到的cDNA从其串联重复序列拆解后进行相互矫正成共识序列(consensus)，以提高测序准确度。Volden等又在2020年将R2C2方法应用于商品化10×Genomic单细胞转录组平台(10XR2C2)，但其拆解出SB的reads仅占所有reads的～32.75％，而同时拆解出SB和UMI的匹配率为～15.86％。除此之外，类似于R2C2但应用场景不同的方法也在近几年不断被开发出来，例如针对超短DNA的HiFRe、针对Phospho-RNA的CircAID-p-seq、针对循环肿瘤DNA(ctDNA，circulating tumor DNA)的TP53-specificCyclomicsSeq等方法，证明通过串联重复序列矫正ONT的理论到了广泛应用。