[发明专利]一种利用分子检测刺芋尖孢镰刀菌的方法

说明书

本申请实施例公开了一种利用分子检测刺芋尖孢镰刀菌的方法，用于提高检测效率。本申请实施例方法包括：提取健康刺芋植株的刺芋健康DNA，得到空白对照DNA组；提取染病刺芋植株的刺芋病株DNA，得到病株DNA组；对病株DNA组进行测序后合成DNA序列，得到病株DNA序列；根据在GenBank的尖孢镰刀菌种群及其他不同种属镰刀菌的基因组片段设计ITS序列；对ITS序列对比分析得到特异性引物I1，特异性引物I2；将空白对照DAN组、特异性引物I1以及特异性引物I2进行RAA等温扩增反应得第一扩增产物；将病株DNA组、特异性引物I1以及特异性引物I2进行RAA等温扩增反应得第二扩增产物；若通过电泳检测第一扩增产物和第二扩增产物存在特异性单一条带出现，则确定染病刺芋植株的基因组片段。

技术领域

本申请实施例涉及生物技术领域领域，尤其涉及一种利用分子检测刺芋尖孢镰刀菌的方法。

背景技术

尖孢镰刀菌尖孢镰刀菌通过分泌毒素与细胞壁降解酶导致宿主植物发病，主要危害葫芦科植物、香蕉、番茄、和棉花等高经济价值作物。尖孢镰刀菌的防控十分困难，主要是因为它除了在宿主植物中存活外，在土壤及空气中存活10年以上仍表现出很强的致病性，能够引起严重的土传病害枯萎病。

尖孢镰刀菌从形态学和分子生物学上与属内多种菌，利用传统的菌种鉴定技术难于区分，引起的枯萎病在生产中的防控也相当困难。尖孢镰刀菌通过分泌毒素和细胞壁降解酶共同致病，谱系特异性区域的存在是其致病性强和宿主范围广的主要原因；在尖孢镰刀菌各专化型中已分离出大量致病相关基因；其他植物和拮抗微生物(木霉菌、丛枝菌根真菌、非致病性尖孢镰刀菌以及植物生长促生菌)可以分泌化感物质，作用于宿主植物和尖孢镰刀菌，直接抑制尖孢镰刀菌的生长或激活宿主植物的防御反应。

传统的病原菌形态学鉴定主要是通过病菌分离、纯化、回接和再分离途径来完成，耗时费力，已经不能满足对植物病原鉴定的要求，通过PRC扩增技术所需要的温度条件为变温，因此扩增的过程持续2小时至4小时，无法快速准确地鉴定镰刀菌种类。

发明内容

本申请实施例提供了一种利用分子检测刺芋尖孢镰刀菌的方法，用于提高检测效率。

本申请实施例提供了一种利用分子检测刺芋尖孢镰刀菌的方法，包括：

S1、对健康刺芋植株提取刺芋健康DNA，得到空白对照DNA组；

S2、对染病刺芋植株提取刺芋病株DNA，得到病株DNA组；

S3、对所述病株DNA组进行测序后合成DNA序列，得到病株DNA序列；

S4、根据在GenBank的尖孢镰刀菌种群及其他不同种属镰刀菌的基因组片段设计ITS序列；

S5、对所述ITS序列进行对比分析后得到特异性引物I1，特异性引物I2；

S6、将所述空白对照DAN组、所述特异性引物I1以及所述特异性引物I2进行RAA等温扩增反应得到第一扩增产物；

S7、将所述病株DNA组、所述特异性引物I1以及所述特异性引物I2进行RAA等温扩增反应得到第二扩增产物；

S8、通过电泳检测所述第一扩增产物和所述第二扩增产物是否存在特异性单一条带出现；

S9、若是，则确定所述染病刺芋植株的基因组片段。

可选地，步骤S1中将所述健康刺芋植株进行消毒后放置于液氮预冷的研钵中研磨得到健康刺芋植株粉末，将所述健康刺芋植株粉末置于1.5ml的EP管中，通过核酸提取试剂盒进行DNA提取，得到空白对照DAN组并放置于-20℃保存。

可选地，步骤S1中将所述染病刺芋植株进行消毒后放置于液氮预冷的研钵中研磨得到染病刺芋植株粉末，将所述染病刺芋植株粉末置于1.5ml的EP管中，通过核酸提取试剂盒进行DNA提取，得到病株DNA组并放置于-20℃保存。