[发明专利]一种重组转氨酶及其在制备尼拉帕利手性中间体中的应用

权利要求书

1.一种重组转氨酶，其特征在于，所述重组转氨酶来源于分支杆菌属(Arthrobactersp)KNK168的编号AT31转氨酶；其中，所述AT31转氨酶的核苷酸序列编码如SEQ No.1所示。

2.一种权利要求1所述的重组转氨酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)：将包括SEQ No.1所示的转氨酶基因的质粒和pET28a载体用同样的限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收双酶切片段，经T4 DNA连接酶连接，形成重组表达质粒AT31-pet28a；

步骤(2)：将步骤(1)得到的重组表达质粒AT31-pet28a转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)，即可获得基因工程菌株E.coliBL21(DE3)/AT31-pet28a；

步骤(3)：将步骤(2)得到的基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/AT31-pet28a接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.8时，加入终浓度为0.05～1.2mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度10～40℃，即可表达所述的重组转氨酶。

3.权利要求1所述的重组转氨酶在制备尼拉帕利手性中间体(S)-5-(4-溴苯基)哌啶-2-酮中的应用。

4.一种制备尼拉帕利手性中间体(S)-5-(4-溴苯基)哌啶-2-酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)：将溴苯与琥珀酸酐混合，冰浴降温至2-5℃；然后加入三氯化铝，室温反应3～6h，反应完毕后分离纯化，制得4-(4-溴苯基)-4-氧丁酸；其中，溴苯、琥珀酸酐和三氯化铝的质量比为180～200:15～25:45～60；

步骤(2)：将步骤(1)所得的4-(4-溴苯基)-4-氧丁酸和4-二甲氨基吡啶加入醇类溶剂中溶解后冰浴，二环己基碳二亚胺用醇类溶剂溶解后缓慢滴加入反应液，反应完毕后分离纯化，制得4-(4-溴苯基)-4-氧代丁酸异丙酯；其中，4-(4-溴苯基)-4-氧丁酸、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的质量比为15～25:3～8:0.1～1；

步骤(3)：在惰性气体保护下，将NaH置于反应容器中，加入1有机溶剂搅拌溶解；取Me₃SOI溶解于有机溶剂中，缓慢加入至NaH溶液中，制备叶立德试剂；将步骤(2)所得的4-(4-溴苯基)-4-氧代丁酸异丙酯用有机溶剂溶解后缓慢加入至所述叶立德试剂中，室温反应10～15min，升温至50～70℃反应25～55min；反应完成后分离纯化，制得4-(4-溴苯基)-5-氧代丁酸异丙酯；

步骤(4)：以步骤(3)所得的4-(4-溴苯基)-5-氧代丁酸异丙酯为反应底物，上述重组转氨酶作为生物催化酶和吡哆醛-5-磷酸酯为辅酶，i-PrNH₂为胺供体，酶法催化制得尼拉帕利手性中间体(S)-5-(4-溴苯基)哌啶-2-酮；其中，4-(4-溴苯基)-4-氧代丁酸异丙酯、重组转氨酶、吡哆醛-5-磷酸酯和i-PrNH₂的质量比为1:50～1:5～0.01～0.1:1:100。

5.如权利要求4所述的制备尼拉帕利手性中间体(S)-5-(4-溴苯基)哌啶-2-酮的方法，其特征在于，所述步骤(1)中溴苯、琥珀酸酐和三氯化铝的质量比为188:20:53。

6.如权利要求4所述的制备尼拉帕利手性中间体(S)-5-(4-溴苯基)哌啶-2-酮的方法，其特征在于，所述步骤(2)中4-(4-溴苯基)-4-氧丁酸、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的质量比为的质量比优选为20:4.8:0.5。

7.如权利要求4所述的制备尼拉帕利手性中间体(S)-5-(4-溴苯基)哌啶-2-酮的方法，其特征在于，所述步骤(2)中醇类溶剂包括乙醇、甲醇、正丙醇和异丙醇中的至少一种。

8.如权利要求4所述的制备尼拉帕利手性中间体(S)-5-(4-溴苯基)哌啶-2-酮的方法，其特征在于，所述步骤(4)中4-(4-溴苯基)-4-氧代丁酸异丙酯、重组转氨酶、吡哆醛-5-磷酸酯和i-PrNH₂的质量比为1:50～1:5～0.01～0.1:1:100。