[发明专利]一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌EC01 S7、构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种联产3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的基因工程菌EC01S7、构建方法和应用，属于生物工程技术领域；本发明中，利用基因工程和合成生物学技术，筛选和协同表达高活性醛脱氢酶和1,3‑丙二醇氧化还原酶同工酶来分摊代谢3‑羟基丙醛的负担，然后通过优化GabD4和YqhD的表达提高了3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的产量，最后通过辅酶工程调控吡啶核苷酸转氢酶来提高辅酶NAD⁺和NADPH循环供应，进而促进3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的深合成；所述高效联产3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的基因工程菌缓解了毒性中间代谢物3‑羟基丙醛积累，并实现细胞内辅酶自给自足，实现了3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的高效生产。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌EC01 S7、构建方法和应用。

背景技术

3-羟基丙酸和1,3-丙二醇是工业上两种重要的平台化合物，作为生物可降解性聚合物的前体物质和食品添加剂广泛使用。3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的生产有化学合成法和生物法两种。化学法多以不可再生资源作为原料，其生产过程能耗大，产物副产物多难以分离纯化，生产过程产生不可估量的环境污染。生物法合成3-羟基丙酸或1,3-丙二醇多以葡萄糖和甘油作为底物，其中以甘油作为底物生产3-羟基丙酸或1,3-丙二醇因其步骤简单，原料廉价，备受瞩目。

以甘油作为底物生物合成3-羟基丙酸或1,3-丙二醇：首先，经甘油脱水酶将甘油脱水生成中间代谢物3-羟基丙醛；后经NAD⁺依赖型醛脱氢酶和NAD(P)H依赖型1,3-丙二醇氧化还原酶/同工酶分别生成3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。

目前，毒性中间代谢物3-羟基丙醛积累和缺乏必要辅因子供应等问题是从甘油可持续生物合成3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的主要瓶颈。一方面，用于3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产的丙醛脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶/同工酶活性不足，极易积累毒性3-羟基丙醛，损坏细胞生长及酶系活性；另一方面，合成3-羟基丙酸需要氧化型辅酶NAD⁺，而生产1,3-丙二醇需要还原型辅酶NAD(P)H，因此单独生产3-羟基丙酸或1,3-丙二醇会造成细胞内氧化还原状态失调，影响细胞正常代谢和3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌EC01 S7、构建方法和应用。本发明中，利用基因工程和合成生物学技术，筛选和协同表达高活性醛脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶来分摊代谢3-羟基丙醛的负担，然后通过优化GabD4和YqhD的表达提高了3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产量，最后通过辅酶工程调控吡啶核苷酸转氢酶来提高辅酶NAD⁺和NADPH循环供应，进而促进3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的深合成；所述高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌缓解了毒性中间代谢物3-羟基丙醛积累，并实现细胞内辅酶自给自足，实现了3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的高效生产。

本发明中提供了一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌EC01 S7，所述EC01 S7 是在大肠杆菌E.coli W3110(DE3)中先表达甘油脱水酶及其再激活因子DhaB123-GdrAB，然后协同表达丙醛脱氢酶GabD4、1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶YqhD和膜结合型吡啶核苷酸转氢酶PntAB，最后敲除E.coli W3110(DE3)基因组中可溶型吡啶核苷酸转氢酶SthA基因而得到。

其中，所述DhaB123-GdrAB的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQID No:2所示；

所述GabD4的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示，氨基酸序列如SEQ ID No:6所示；

所述YqhD的核苷酸序列如SEQ ID No:7所示，氨基酸序列如SEQ ID No:8所示；