[发明专利]一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌EC01 S7、构建方法和应用

权利要求书

1.一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌EC01 S7，其特征在于，所述基因工程菌为EC01 S7，EC01 S7是在大肠杆菌E.coli W3110(DE3)中先表达甘油脱水酶及其再激活因子DhaB123-GdrAB，然后协同表达丙醛脱氢酶GabD4、1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶YqhD和膜结合型吡啶核苷酸转氢酶PntAB，最后敲除E.coli W3110(DE3)基因组中可溶型吡啶核苷酸转氢酶SthA基因而得到。

2.根据权利要求1所述的联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌EC01 S7，其特征在于，所述DhaB123-GdrAB的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

3.根据权利要求1所述的联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌EC01 S7，其特征在于，所述GabD4的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示，氨基酸序列如SEQ ID No:6所示；

所述YqhD的核苷酸序列如SEQ ID No:7所示，氨基酸序列如SEQ ID No:8所示；

所述PntAB的核苷酸序列如SEQ ID No:11所示，氨基酸序列如SEQ ID No:12所示。

4.根据权利要求1所述的联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌EC01 S7，其特征在于，所述SthA的核苷酸序列如SEQ ID No:13所示，氨基酸序列如SEQ ID No:14所示。

5.权利要求1所述的高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌EC01 S7的构建方法，其特征在于，包括：

(1)表达甘油脱水酶及其再激活因子的重组质粒构建：

PCR扩增甘油脱水酶-甘油脱水酶再激活因子大亚基DhaB123-GdrA基因片段和甘油脱水酶再激活因子小亚基GdrB基因，使用融合PCR技术融合上述两个基因，形成完整的甘油脱水酶及其再激活因子DhaB123-GdrAB基因片段，然后克隆至pACYCDuet-1质粒，获得表达DhaB123-GdrAB的重组质粒；

(2)协同表达GabD4、YqhD和PntAB的重组质粒的构建：

PCR扩增来源于钩虫贪铜菌的GabD4基因，然后克隆至pETDuet-1质粒中，获得表达GabD4的重组质粒；

PCR扩增来源于大肠杆菌的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶YqhD基因，然后克隆至pETDuet-1质粒中，获得表达YqhD的重组质粒；

PCR扩增表达YqhD的重组质粒上的YqhD基因，将其克隆至表达GabD4的重组质粒中，获得协同表达GabD4和YqhD的重组质粒；

PCR扩增大肠杆菌中膜结合型吡啶核苷酸转氢酶PntAB基因，并将其克隆至协同表达GabD4和YqhD的重组质粒中，得到协同表达GabD4、YqhD和PntAB的重组质粒；

(3)联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌EC01 S7的构建：

使用CRIPSR-CAS9基因编辑工具，敲除E.coliW3110(DE3)基因组中的可溶型吡啶核苷酸转氢酶SthA基因，获得SthA基因敲除工程菌；

将步骤(2)中协同表达GabD4、YqhD和PntAB的重组质粒和步骤(1)中表达DhaB123-GdrAB的重组质粒转入SthA基因敲除工程菌中，得到所述高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌，记为EC01 S7；

其中，步骤(1)和(2)不分先后顺序。

6.根据权利要求5所述的联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌EC01 S7的构建方法，其特征在于，步骤(1)～(3)中，PCR反应参数均为：预变性98℃2min；变性98℃15s；退火55℃10s；延伸72℃2min；终延伸72℃5min，33个循环。