[发明专利]一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌、构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种联产3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的基因工程菌、构建方法和应用，属于生物工程技术领域；在本发明中，以EC01工程菌(SthA基因敲除工程菌)作为出发菌株，通过代谢途径模块化策略将重组质粒pS0和pS7的基因元件作为两个模块，利用基于复制子的代谢途径平衡策略，使用不同拷贝数的质粒表达上述两个模块，减少中间代谢物3‑羟基丙醛，提高联产3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的产率；此外，还通过敲除副产物途径消除或减少副产物乳酸、乙醇、甲酸和醋酸的生成，进而提高联产3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的产率。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌、构建方法和应用。

背景技术

3-羟基丙酸和1,3-丙二醇是工业上两种重要的平台化合物，作为生物可降解性聚合物的前体物质和食品添加剂广泛使用。3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的生产有化学合成法和生物法两种。化学法多以不可再生资源作为原料，其生产过程能耗大，产物副产物多难以分离纯化，生产过程产生不可估量的环境污染。生物法合成3-羟基丙酸或1,3-丙二醇多以葡萄糖和甘油作为底物，其中以甘油作为底物生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇步骤简单，研究充分，原料廉价，且能解决甘油过剩的问题。

从甘油生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇，首先，经甘油脱水酶将甘油脱水生成中间代谢物3-羟基丙醛；后经NAD⁺依赖型醛脱氢酶和NAD(P)H依赖型1,3-丙二醇氧化还原酶/同工酶分别生成3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。

目前，积累毒性中间代谢物3-羟基丙醛以及生成乳酸、乙醇、甲酸和醋酸等副产物是工业发酵甘油生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的主要瓶颈。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌、构建方法和应用。在本发明中，以EC01工程菌(SthA基因敲除工程菌)作为出发菌株，通过代谢途径模块化策略将重组质粒pS0和pS7的基因元件作为两个模块，利用基于复制子的代谢途径平衡策略，使用不同拷贝数的质粒表达上述两个模块，减少中间代谢物3-羟基丙醛，提高联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产率；此外，还通过敲除副产物途径消除或减少副产物乳酸、乙醇、甲酸和醋酸的生成，进而提高联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产率。

本发明中首先提供了一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌，所述基因工程菌敲除出发菌株EC01工程菌中的乳酸脱氢酶(LdhA)、乙醇脱氢酶(AdhE)、丙酮酸甲酸裂解酶(PflB)、丙酮酸氧化酶(PoxB)、磷酸乙酰转移酶-醋酸激酶(PTA-AckA)基因后表达不同拷贝数的模块1和模块2得到；

所述EC01工程菌为SthA基因敲除工程菌；

所述模块1为重组质粒pS0上的DhaB123-GdrAB基因元件；

所述模块2为重组质粒pS7上的GabD4、YqhD和PntAB基因元件。

其中，所述重组质粒pS0的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；所述重组质粒pS7的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

所述不同拷贝数为：将pCLOADuet-1、pCDFDuet-1或pETDuet-1线性化质粒与模块1组装，将pACYCDuet-1、pCDFDuet-1和pRSFDuet-1线性化质粒模块2组装来实现。

本发明中还提供了上述联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：

(1)含不同拷贝数的模块1重组质粒构建：