[发明专利]一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法

权利要求书

1.一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，对宫颈细胞样本进行提取处理得到细胞DNA样本，接着对细胞DNA样本进行重亚硫酸盐快速转化，得到转化产物；

S2，对转化产物进行酶切处理，得到酶切产物，再对得到的酶切产物进行PCR扩增，得到PCR扩增引物组；

S3，对PCR扩增引物组进行实时荧光定量PCR检测，并计算出甲基化程度。

2.根据权利要求1所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述S1中提取处理的具体操作步骤为：

S11，将宫颈细胞样本送入离心机中进行离心处理，处理结束后移除上清液，得到样本沉淀物；

S12，将样本沉淀物、蛋白酶K和裂解液ABL混合，混合均匀后进行孵育，得到样本DNA，孵育的时间为45min-50min，所述孵育的温度为55℃-58℃。

3.根据权利要求1所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述S1中重亚硫酸盐快速转化的具体操作步骤为：

S21，将NaHSO₃和(NH₄)₂SO₃·H₂O溶于6.5ml(NH₄)HSO₃溶液中，加热至90℃至完全溶解，冷却至室温，检测溶液的pH应在5.4–5.5，得到转化液；

S22，将细胞DNA样本加入55ul转化液中，在85℃下处理15min，冷却至室温，得到转化产物。

4.根据权利要求1所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述S2中酶切处理使用的是限制性内切酶反应液，且限制性内切酶反应液由限制性内切酶和限制性内切酶酶切缓冲液混合制成。

5.根据权利要求1所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述PCR扩增引物组包括目标基因引物组、目标基因引物组的上游引物以及目标基因引物组的下游引物。

6.根据权利要求1所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述S3的具体操作步骤为：

S31，以dTTP、dGTP、dATP以及第三标记物作为底物，将PCR扩增产物组加入到固定有亲和素受体的酶标板中，使PCR扩增产物通过第三标记物与亲和素受体的作用固定到酶标板上；

S32，使用第一荧光标记物标记目标基因引物组的上游引物，用第二荧光标记物标记目标基因引物组的下游引物，用酶标仪测量第一荧光标记物和第二荧光标记物的信号强度，第一荧光标记物的信号强度为M，第二荧光标记物的信号强度为N；

S33，计算出N/M的数值，即为宫颈细胞样品中基因甲基化程度。

7.根据权利要求5所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述第一荧光标记物为FITC，第二荧光标记物为Cy5，第三标记物为生物素。

8.根据权利要求2所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述S11中离心机的离心时间为2.5min-3min，离心转速为16000rpm-17000rpm。

9.根据权利要求2所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述S12中宫颈脱落细胞样本、蛋白酶K和裂解液ABL的体积比为70:1:10。

10.根据权利要求3所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述S21中NaHSO₃与(NH₄)₂SO₃·H₂O的质量比为3比1，(NH₄)HSO₃的浓度为50％。