[发明专利]一种快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法及其应用。本发明通过采用双层琼脂平板法和qPCR的方法结合，建立以Pf4和Pf6单链丝状噬菌体每个稀释梯度下的qPCR测定得到的Ct值(Y轴)与每个稀释梯度下Pf4和Pf6单链丝状噬菌体的数量(X轴)的标准曲线。通过双层琼脂平板法和qPCR测定的方法结合可以快速高效地对丝状噬菌体ssDNA的基因组进行定量，还可以对两个同时释放的ssDNA丝状噬菌体进行分别定量和比较。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法及其应用。

背景技术

噬菌体是侵染细菌的病毒，它们是介导微生物基因水平转移的重要方式之一，是推动细菌基因组进化的原动力之一。噬菌体在分子生物学、抗菌制剂和噬菌体展示等方面得到广泛应用，噬菌体治疗最近成为多重耐药菌治疗的热门方法之一。温和性噬菌体进入细菌后，先“潜伏”下来，与宿主的复制步调保持一致。当收到外界传来的特定信号(如抗生素、紫外线等)，这些潜伏者就会被唤醒，毫不犹豫地“冲”出宿主细胞，导致宿主细菌死亡。这些激活的温和噬菌体携带的遗传物质包括单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)，单链RNA和双链RNA，其中噬菌体基因组大部分为dsDNA。丝状噬菌体发现于半个世纪以前，是目前已知最简单的生物实体之一，其基因组大小约为7-12kb，为ssDNA。

由于噬菌体侵染细菌的过程中会造成细菌的裂解，抑制细菌的生长，会在含有特异宿主细菌的琼脂平板上出现噬菌斑，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑。目前，最流行的方法是通过一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价，称为双层琼脂平板法。然而，双层琼脂平板法从平板制备到侵染实验的开展，直至观察到清晰的噬菌斑耗时较长(长达18-24小时)，如果同一批样品中需要设置不同时间点进行噬菌体的定量，则需要反复开展双层平板的制作和点板，耗时耗力，且效率低。其操作需要相对无菌的环境，如果噬菌体中含有两种及两种以上的基因组高度类似的噬菌体，则通过双层琼脂平板法只能对噬菌体培养液中的噬菌体总量进行定量，无法对每种噬菌体进行定量，其不适合具有多个溶原噬菌体的检测。另外一种采用相对较多的方法是基于聚合酶链式反应(PCR)的荧光定量qPCR技术，该技术通过设计噬菌体基因特定区域的引物，实现了对dsDNA噬菌体效价的有效定量。目前，报道用qPCR方法定量的噬菌体基因组主要为dsDNA和RNA，针对ssDNA基因组的相对较少，且这些报道的qPCR方法需要对噬菌体的DNA进行提取，然后再进行荧光定量PCR。尤其是目前发现丝状噬菌体的释放并不直接裂解宿主，所以噬菌斑的形成能力较弱。因此，开发高效准确的方法对丝状噬菌体进行定量，区分高度相似噬菌体混合培养液中每种噬菌体的比例，对于ssDNA噬菌体-宿主的相互作用和不同环境因子及宿主对丝状噬菌体的释放的具有一定的科学意义，除此之外，对丝状噬菌体以及宿主的致病性研究也具有重要的现实意义。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，建立可以对丝状噬菌体内ssDNA进行有效扩增的基于荧光定量的qPCR方法，以实现分别对宿主菌内高度相似噬菌体的单独定量，也可以对同时含有相似噬菌体的样品中噬菌体进行分别定量，并确定其比例，该方法可以更高效更精确的对ssDNA噬菌体进行定量。

本发明的第一个目的是提供一种快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法，包括以下步骤：

(1)将铜绿假单胞菌菌液注入微流控装置的医用硅胶管中，静置，使细菌吸附在硅胶管内壁，启动微流控装置，以M9培养基在室温下进行细菌的生物膜培养，收集流出液，用微孔滤膜过滤，得到无菌的噬菌体液；

(2)构建同时敲除Pf4和Pf6噬菌体基因的铜绿假单胞菌ΔPf4-Pf6，将铜绿假单胞菌ΔPf4-Pf6菌液与R-top培养基混合后平铺于LB平板；以步骤(1)得到的噬菌体液作为原液，进行梯度稀释，将原液和稀释液分别点板于LB平板上，过夜培养，根据噬菌斑统计原液和稀释液中的噬菌体总数量；