[发明专利]一种快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法及其应用

权利要求书

1.一种非疾病诊断和治疗目的的快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将铜绿假单胞菌菌液注入微流控装置的医用硅胶管中，静置，使细菌吸附在硅胶管内壁，启动微流控装置，以M9培养基在室温下进行细菌的生物膜培养，收集流出液，用微孔滤膜过滤，得到无菌的噬菌体液；

(2)构建同时敲除Pf4和Pf6噬菌体基因的铜绿假单胞菌ΔPf4-Pf6，将铜绿假单胞菌ΔPf4-Pf6菌液与R-top培养基混合后平铺于LB平板；以步骤(1)得到的噬菌体液作为原液，进行梯度稀释，将原液和稀释液分别点板于LB平板上，过夜培养，根据噬菌斑统计原液和稀释液中的噬菌体总数量；

(3)分别往噬菌体原液和稀释液中加入DNase I和RNase I进行处理，然后以引物对pfkA-F/pfkA-R、pfiA-F/pfiA-R对经DNase I和RNase I处理后的噬菌体原液和稀释液进行qPCR检测，所述引物对pfkA-F/pfkA-R的序列为pfkA-F：5'-CGACCTGAAACCAACAAACG-3'，pfkA-R：5'-TTAAACCATTGCTGAAAGGG-3'；所述引物对pfiA-F/pfiA-R的序列为：pfiA-F：5'-ATGCGGCTGACCTGGATT-3'，pfiA-R：5'-TGAGCGAACCTCCTGGAAA-3'，测定噬菌体原液和稀释液中Pf4和Pf6噬菌体的Ct值；

(4)根据步骤(2)测得的噬菌体总数量，以及由步骤(3)测得的Pf4和Pf6噬菌体的Ct值计算得到的Pf4和Pf6的比例，确定噬菌体原液和稀释液中Pf4和Pf6噬菌体各自的数量；

(5)以Pf4或Pf6噬菌体每个稀释浓度下测得的Ct值为纵坐标，每个稀释浓度下测得的噬菌体数量为横坐标，建立标准曲线，根据qPCR测定的Ct值得到对应单个类型丝状噬菌体的数量；

所述的R-top培养基的配方为：每升培养基含1％胰蛋白胨、0.1％酵母粉、1％NaCl、0.8％琼脂，余量为水；

所述铜绿假单胞菌ΔPf4-Pf6的构建步骤为：

S1：通过PCR从铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA中扩增出Pf4的上下游区域，扩增Pf4上游基因引物ΔPf4-F1：5'-GCCCCCGAGCTCGTTATTGGTCGTGGTTGCTTCCC-3'和ΔPf4-R1：5'-GCCCCCGCTAGCGATCCCAATGCAAAAGCCCC-3'，扩增Pf4下游基因引物ΔPf4-F2：5'-GCCCCCGCTAGCTGGAGCGGGCGAAGGGAATCGAACCCTCG-3'和ΔPf4-R2：5'-GCCCCCAAGTTCAGCCTGGACGAGCACGAATACC-3'；通过PCR从质粒pPS856中扩增出庆大霉素抗性基因盒，扩增庆大霉素抗性基因盒引物pEX18Gm-F：5'-AATCTTCTCTCATCCGCCAAAACA-3'和pEX18Gm-R：5'-CGCCCAATACGCAAACCGCCTCTC-3'；然后用ClonExpress II一步克隆试剂盒将这三个扩增片段连接到自杀质粒pEX18Ap中；采用蔗糖抗性筛选方法，通过同源重组获得框内缺失突变体，即为铜绿假单胞菌ΔPf4；

S2：以铜绿假单胞菌ΔPf4基因组DNA为模板，扩增出Pf6的上下游区域，扩增Pf6上游基因引物ΔPf6-F1：5'-ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTCTGGCTACAAATTGACCACATG-3'和ΔPf6-R1：5'-AGCGCAGCATTGTTTTGGTCGGCAGACTACAA-3'，扩增Pf6下游基因引物ΔPf6-F2：5'-GACCAAAACAATGCTGCGCTCTAACCGACT-3'和ΔPf6-R2：5'-GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGGGCAAGCCGGCGCGTTC-3'；通过PCR从质粒pPS856中扩增出庆大霉素抗性基因盒；然后用ClonExpressII一步克隆试剂盒将这三个扩增片段连接到自杀质粒pEX18Ap中；采用蔗糖抗性筛选方法，通过同源重组获得框内缺失突变体，即为铜绿假单胞菌ΔPf4-Pf6。