[发明专利]牛骨骼肌生成相关MEF2C mRNA m6

说明书

本发明涉及牛骨骼肌生成相关MEF2C mRNA m⁶A甲基化位点鉴定，根据m⁶A‑seq测序的结果，通过生物信息学分析确定MEF2C mRNA上m⁶A甲基化位点的准确位置，并通过m⁶A‑IP‑qPCR验证MEF2C mRNA的m⁶A水平在肌生成中的显著变化；通过m⁶A位点的同义点突变改变MEF2C的m⁶A甲基化水平，并影响MEF2C蛋白表达，证明了MEF2C mRNA m⁶A甲基化具有影响骨骼肌生成的功能；通过双荧光素酶报告系统和RIP实验证明MEF2C的表达受METTL3‑m⁶A‑YTHDF1轴的调控。为m⁶A甲基化修饰调控肌肉生长发育的功能研究提供参考，为肉牛的定向选育提供了新的分子标记。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种单个基因mRNA m⁶A甲基化位点鉴定、功能及应用，具体涉及牛骨骼肌生成相关MEF2C mRNA m⁶A甲基化位点鉴定、功能及应用。

背景技术

研究表明，畜禽的产肉量和肉品质离不开骨骼肌的生长发育及其遗传特性，一方面，骨骼肌肌纤维的数量和直径是决定动物产肉量的关键因素；另一方面，骨骼肌中肌内脂肪含量、肌纤维内蛋白质种类和数量与肌肉的嫩度密切相关，并影响肉品质。除此以外，骨骼肌是机体重要的运动和能量代谢组织，对于维持机体代谢平衡和稳态起到重要作用。因此，研究骨骼肌的生长发育规律对于提高肉用动物生产性能和研究肌肉生理病理学十分必要。同时，由于我国肉牛业起步较晚，本土的地方黄牛品种一直饱受生长速度慢、产肉性能较国外优良肉牛品种差距较大等因素的困扰，如何提高地方黄牛的产肉量和肉品质是国内肉牛育种工作者亟待解决的共同问题。

肌生成是一个非常复杂的生物学过程，从肌卫星细胞激活到成肌细胞增殖最终到终末分化阶段，这一过程除了受到关键的转录因子调控外，一些表观遗传如DNA甲基化、组蛋白修饰等也发挥着重要的作用。而m⁶A作为真核生物最为普遍的mRNA甲基化修饰，自被发现具有动态可逆性后，相关领域开始快速发展。已发现m⁶A修饰通过介导mRNA代谢，包括影响RNA翻译效率、稳定、剪切等进而调控多种生物学过程。哺乳动物中mRNA上m⁶A甲基化修饰的基序通常具有物种保守性，一般发生为“RRACH”序列，其中R表示鸟嘌呤（G）或者腺嘌呤（A）；H表示腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）或尿嘧啶（U）。近年来的研究已经发现m⁶A修饰参与肌肉生长发育的调控。在小鼠骨骼肌原代成肌细胞和C2C12细胞中，m⁶A修饰调控其成肌分化。随着m⁶A特异性甲基化RNA免疫沉淀高通量测序技术（MeRIP-seq/m⁶A-seq）的发明，已有多个研究表明m⁶A修饰具有潜在调控猪、牛、鸡、鹅、羊等畜禽的脂肪和肌肉发育的重要作用。然而，关于m⁶A修饰在牛骨骼肌生成中的功能、作用机制以及潜在靶基因仍未报道。

众所周知，MEF2C是调控骨骼肌生成的关键转录因子，根据前期的m⁶A测序发现MEF2C mRNA m⁶A甲基化水平在秦川牛骨骼肌成肌细胞分化前后的存在显著差异，暗示MEF2C可能受到m⁶A甲基化修饰的调控，因此，有必要对MEF2C mRNA的m⁶A甲基化位点及功能进行分析鉴定，为研究m⁶A调控肌肉生长发育的功能研究提供参考，为肉牛的定向选育提供一种新的分子标记。

发明内容