[发明专利]牛骨骼肌生成相关MEF2C mRNA m6 有效
| 申请号： | 202210095273.3 | 申请日： | 2022-01-26 |
| 公开（公告）号： | CN114592067B | 公开（公告）日： | 2023-03-28 |
| 发明（设计）人： | 杨昕冉;昝林森 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6888 | 分类号： | C12Q1/6888;C12Q1/6858;C12Q1/6809;C12N15/10;G01N33/68;C12Q1/66 |
| 代理公司： | 西安恒泰知识产权代理事务所 61216 | 代理人： | 李郑建 |
| 地址： | 712100 陕*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 骨骼肌 生成 相关 mef2c mrna base sup | ||
1.一种与牛骨骼肌生成相关MEF2C mRNA m6A甲基化位点鉴定方法，根据m6A-seq测序结果分析得到的RNA片段中存在m6A甲基化位点，其特征在于：
（1）根据哺乳动物中高度保守的RRACH序列进行MEF2C mRNA上m6A位点位置的确定；所述的RRACH序列中，R=G，A；H=A，C，U；
（2）根据测序结果中的m6A甲基化位点在MEF2C mRNA上的位置，设计含有m6A位点的定量引物：
MEF2C-m6A-F：5’-TCACCGGAACGAATTCCACT-3’
MEF2C-m6A-R：5’-GCCCATCCTTCAGAGAGTCG-3’
通过m6A免疫沉淀后的实时荧光定量PCR技术检测MEF2C mRNA的m6A甲基化水平在牛成肌细胞分化过程中的变化，验证m6A-seq测序的结果，证明MEF2C mRNA在Ensembl数据库中的序列号为ENSBTAT00000086206.1，MEF2C mRNA m6A甲基化位点位于ENSBTAT00000086206.1序列的第1248位核苷酸。
2.一种改变MEF2CmRNA m6A甲基化修饰水平的方法，其特征在于：MEF2C mRNA在Ensembl数据库中的序列号为ENSBTAT00000086206.1，MEF2C mRNA m6A甲基化位点位于ENSBTAT00000086206.1序列的第1248位核苷酸，将ENSBTAT00000086206.1序列的第1248位腺苷酸同义突变为胞嘧啶，降低MEF2C mRNA的m6A甲基化修饰水平。
3.一种MEF2CmRNA m6A甲基化修饰对骨骼肌分化影响的鉴定方法，其特征在于：
（1）通过将牛MEF2C基因甲基化位点由腺苷酸同义突变为胞嘧啶，分别构建野生型和突变型表达质粒；所述MEF2CmRNA在Ensembl数据库中的序列号为ENSBTAT00000086206.1，MEF2C mRNA m6A甲基化位点位于ENSBTAT00000086206.1序列的第1248位核苷酸；
（2）分别将野生型和突变型表达质粒转染进牛骨骼肌成肌细胞；
（3）24小时后，诱导成肌细胞进行成肌分化；
（4）利用免疫荧光和RT-qPCR技术检验野生型表达质粒和突变型表达质粒对成肌分化的影响，从而证明MEF2CmRNA的m6A甲基化位点对骨骼肌成肌分化具有抑制作用。
4.一种检测MEF2CmRNAm6A甲基化调控的方法，其特征在于：
（1）将MEF2C mRNA m6A甲基化位点由腺苷酸同义突变为胞嘧啶后，分别构建野生型和突变型MEF2C双荧光素酶表达质粒，利用双荧光素酶报告系统分别检测m6A甲基转移酶METTL3、m6A阅读蛋白YTDHF1与野生型或m6A甲基化位点突变后MEF2C mRNA的结合调控；MEF2C mRNA在Ensembl数据库中的序列号为ENSBTAT00000086206.1，MEF2C mRNA m6A甲基化位点位于ENSBTAT00000086206.1序列的第1248位核苷酸；
（2）利用RNA结合蛋白免疫共沉淀技术检测YTHDF1蛋白与MEF2C mRNA m6A甲基化位点区域的结合。
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