[发明专利]DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记及其开发方法与应用

说明书

本发明公开了一种DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记及其开发方法与应用。采用兰花组织培养中常用的两种植物激素NAA和6‑BA处理铁皮石斛幼苗，对铁皮石斛幼苗中的主要药用化合物进行了比较分析，并对相应样品进行转录组测序分析差异表达基因，明确了不同处理条件下化合物积累和差异基因表达模式的对应关系。其中，DcBGLU2L基因表达与多糖含量密切相关，其表达水平可以指示多糖积累水平，因此可以作为指示多糖含量的分子标记；可以应用在生产实践中，对不同激素处理、不同浓度、不同处理时间、不同生长时期受体材料中的多糖含量进行监测；也为人工控制石斛活性成分的生产铺平了道路。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记及其开发方法与应用。

背景技术

石斛属是兰科植物中最大的属之一，在世界范围内包含1500多种，具有很高的经济和科学研究价值。铁皮石斛(D.officinale)是一种广泛分布于亚洲亚热带的濒危多年生附生草本植物，被列为最珍贵的石斛属植物之一，具有健胃、促进体液分泌、调节免疫、抑癌等多种功效。其茎中含有多种活性成分，主要包括多糖、生物碱、黄酮类、酚类等。

铁皮石斛根据消费者的喜好可以果汁、粉末、胶囊和功能性酒或茶的形式广泛用于药物和膳食补充剂，导致对该物种的需求不断增加以及农业生产集约化。据报道，2018年中国南方有6000多公顷的农地用于生产近2万多吨铁皮石斛鲜条。因此，铁皮石斛生产的质量至关重要，它会受到多种遗传和环境因素的影响，导致其活性成分含量不稳定。

目前在铁皮石斛快繁体系中广泛使用的培养基诱导种子萌发导致了后代表型性状和药用品质不稳定。因此，如何准确在铁皮石斛组织培养扩繁的生产过程中对多糖等活性成分的实时监测，并根据监测结果进行培养基微调是确保产品品质稳定的关键环节。

发明内容

本发明提供了一种DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记及其开发方法与应用，以实现实时、可跟踪的监测不同激素处理、不同处理时间、不同浓度、不同生长时期受体材料中多糖含量。

实现本发明目的的技术解决方案为：

一种DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记，分子标记DcBGLU2L在NCBI gene bank中的基因检索编号为Loc110095182，通过引物对以石斛RNA反转录的cDNA为模板，采用qRT-PCR扩增来指示其表达水平。

优选的，所述引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

所述的SEQ ID NO.1序列为：5'-CTTTCAGCAAATCAGAATCCCA-3'；

所述的SEQ ID NO.2序列为：5'-ATGCCTGACTGGTTGGTGGA-3'。

一种DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记的开发方法，对组织培养中激素处理后的石斛样品进行qRT-PCR基因表达检测，与对照样品进行比较，其表达量与多糖含量呈正相关关系，据此判断多糖含量的变化情况。

优选的，所述qRT-PCR基因表达检测具体为，取用少量样品进行微量RNA提取及逆转录成cDNA，采用qRT-PCR方法对DcBGLU2L基因表达水平进行检测和比较。

优选的，所述少量样品为50-100mg的植物组织鲜样。

优选的，所述少量样品为叶片、1cm长的茎、根部组织、圆球体或愈伤组织。

优选的，利用RNAi敲低DcBGLU2L的表达，样品中多糖含量相应降低。

优选的，步骤如下：

步骤1.石斛材料处理；

步骤2.多糖含量测定；

步骤3.cDNA文库制备和转录组测序；

步骤4.转录组数据处理与分析；

步骤5.实时定量qRT-PCR验证；