[发明专利]一种DNA甲基转移酶1的抗原肽及其多克隆抗体

说明书

本发明具体涉及一种DNA甲基转移酶1的抗原肽及其多克隆抗体，属于分子克隆技术领域。本发明根据NCBI公布的预测的猪DNMT1序列，通过RT‑PCR扩增得到了猪的DNMT1基因，利用真核表达系统构建了pFlag14‑DNMT1(cloned)重组质粒，从猪DNMT1蛋白序列开始分析，构建能够得到符合后续检测要求的猪DNMT1蛋白合成肽多克隆抗体。本发明公开多克隆抗体检测灵敏度高、特异性强，适用于人、猪、猴、牛、犬源DNMT1蛋白的快速检测和相关研究。

技术领域

本发明属于分子克隆技术领域，具体涉及一种DNA甲基转移酶1的抗原肽及其多克隆抗体、制备方法及应用。

背景技术

DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)是哺乳动物基因组表观遗传修饰中DNA甲基化的关键基因，其编码的蛋白是一种分子量大且功能复杂的酶，具有多种调控功能，参与机体发育过程中干细胞生长、细胞增殖、器官发育、衰老和肿瘤发生等多个生物学过程。一旦生物体内Dnmt活性发生变化，将会引起基因组甲基化水平异常，使5'-CG-3'核苷酸岛局部甲基化水平升高和基因组整体甲基化水平降低，从而导致基因组不稳定，如染色体不稳定、可移动遗传因子激活、原癌基因表达和抑癌基因不表达等。因此分析Dnmt的活性对疾病的预防、治疗和癌症发生机制的研究有着十分重要的运用价值。

中国发明专利CN201210202062.1公开了O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测方法，即首次采用生物发光共振能量转移技术和化学发光技术免疫检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性：将链亲和素-荧光素酶融合蛋白与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在0～40℃孵育30～60min，再加入荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体，0～40℃孵育30～60min，然后再加入荧光素底物，4～30℃下静置5～30min，检测670nm处的发光强度，进而计算获得O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性。

中国发明专利CN201510595903.3公开了一种基于链置换放大和DNAzyme放大的检测DNA甲基转移酶活性的方法。设计一种三功能双链DNA探针，利用DNA甲基转移酶特异性地识别该三功能双链DNA探针发生甲基化，HpaII限制性内切酶特异性地切割残余的未甲基化的双链DNA，甲基化的双链DNA引发链置换反应，释放大量的8–17DNAzyme，8–17DNAzyme催化大量发夹型分子信标底物的切割，引发显著的荧光增强。

上述检测方法均使用了荧光染料的方式进行了DNA甲基转移酶1的定量分析，但存在特异性较低，分析过程复杂的缺点，因此有必要开发一种能够用来快速检测的抗体，以便通过抗体进一步研究DNMT1的功能。有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明根据NCBI公布的预测的猪DNMT1序列，通过RT-PCR扩增得到了猪的DNMT1基因，利用真核表达系统构建了pFlag14-DNMT1(cloned)重组质粒，从猪DNMT1蛋白序列开始分析，构建能够得到符合后续检测要求的猪DNMT1蛋白合成肽多克隆抗体，为DNMT1蛋白功能及作用机制的研究奠定重要的材料基础，为DNMT1在家畜方面的研究提供了基础资料。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:

本发明请求保护一种DNA甲基转移酶1的抗原肽，所述DNA甲基转移酶1的抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.l所示，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该核苷酸序列根据GenBank中的猪DNMT1基因预测序列(XM_021082029.1)上进行选择，猪DNMT1基因预测序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还请求保护一种由所述DNA甲基转移酶1的抗原肽免疫新西兰大白兔制备得到的多克隆抗体。

本发明还请求保护一种抗DNMT1多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤: