[发明专利]一种原位杂交探针及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种原位杂交探针及其制备方法与应用。以目标基因组为模板使用滚环扩增试剂进行滚环扩增，获得原位杂交探针前体，对所述原位杂交探针前体进行超声处理或PCR扩增，得到所述原位杂交探针，所述滚环扩增试剂包括结合序列C‑seq、DNA连接酶、DNA聚合酶和dNTPs。所述方法能够高效制备原位杂交探针，且可有效避免重复片段的杂交探针，所制备探针杂交后背景低，信号清晰，无需COT DNA封闭。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种原位杂交探针及其制备方法与应用。

背景技术

原位杂交技术(In-Situ Hybridization，简称ISH)是以带有标记物的DNA小片段，即杂交探针，与组织或细胞内的DNA同源靶序列进行杂交，通过检测标记物所产生的信号，来检测标本中DNA(或基因)或染色体数目或位置变化的一种分子细胞遗传学技术。荧光原位杂交技术(Florescence In-Situ Hybridization，简称FISH)是以荧光标记的DNA探针与组织或细胞内的DNA同源序列进行杂交，通过在荧光显微镜下观察和计数各种荧光信号的数量和分布来记录和分析结果。

通常使用的探针包括克隆化酶标探针和化学合成探针。克隆化酶标探针使用较广泛，以包含基因组片段的克隆(YAC、PAC、BAC等)为DNA模板，通过各种酶扩方法制备探针，优点在于实现过程相对简单，但缺点表现在因为基因组中含有重复区段和一些非靶序列，无法选择标记，且受限于克隆库本身，只能对经过确认的克隆进行标记；化学合成探针是通过化学合成的方法制备的寡核苷酸探针，但受限于合成技术，当合成长度大于59nt时，合成成本翻倍，且合成难度直线上升。

CN109439751A公开了一种用于KIAA1549-BRAF融合基因检测的探针制备方法，使用两个标记不同颜色的探针库进行检测，去重复序列分析后，进行序列分割1kb左右区块，使用OligoArray进行探针设计、筛选，要求长度50bp，TM值85-99℃，探针最小间隔5bp，随后在两端分别加上通用接头进行合成，单条序列的合成长度约85bp，以合成的寡核苷酸库为模板，使用带有荧光标记的通用引物进行扩增，得到两组荧光探针。该方法通过人工合成制备模板库，然后使用带标记的通用引物，基于PCR方法扩增得到探针库，可以实现对于间隔较小的融合检测，但人工合成探针数量较高(约60条长片段合成)，且方法是借助于通用引物的荧光基团实现荧光检测，每100bp带有两个标记，标记效率略显不足，且受限于PCR扩增的体积和设备制约，批量化生产时产能有限。

综上所述，如何提供一种高效、低成本的原位杂交探针制备方法，制备高特异性探针，是分子生物学检测技术领域亟需解决问题之一。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种原位杂交探针及其制备方法与应用，通过酶连成环和等温扩增实现高效、低成本制备原位杂交探针，制备的原位杂交探针具备高特异性，且能够进行特殊易位类型检测。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种制备原位杂交探针的方法，所述方法包括：

以目标基因组为模板使用滚环扩增试剂进行滚环扩增，获得原位杂交探针前体，对所述原位杂交探针前体进行超声处理或PCR扩增，得到所述原位杂交探针，所述滚环扩增试剂包括结合序列C-seq、DNA连接酶、DNA聚合酶和dNTPs，所述结合序列C-seq从5’端至3’端依次包括5’靶结合区、通用引物结合区F、T7启动子区、通用引物结合区R和3’靶结合区，所述5’靶结合区和3’靶结合区能够与目标基因组互补结合。

本发明中，分析目标基因组序列，选择非重复区设计并合成与靶区域互补的结合序列C-seq，所述结合序列C-seq在DNA连接酶作用下能形成环状模板，结合示意图如图1所示，在聚合酶作用下进行滚环扩增，获得原位杂交探针前体，并进一步通过超声处理或PCR扩增获得原位杂交探针，能够有效避免重复片段的杂交探针，杂交后背景低，信号清晰，无需COT DNA封闭。