[发明专利]测定羧酸酯酶1的特异性生物发光探针底物及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种测定羧酸酯酶1活性的特异性荧光探针底物及其制备方法和应用。该探针底物可用于不同种属来源的细胞或组织样本中CES1酶活性的定量检测，还可用于CES1调控剂的快速筛选，同时可以作为实验动物在体及整体CES1的探针底物，评估代谢酶CES1的个体及种属差异。本发明还公开了该探针底物的制备方法。本发明CES1荧光探针底物检测CES1单酶体外活性具有高特异性，高灵敏度，高检测便利性及高通量检测性，与荧光探针相比具有不同的检测方式，基本不受生物基质的干扰，且具有更高的选择性和精确性。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种测定羧酸酯酶1的特异性生物发光探针底物，以及这种探针的制备方法及应用。

背景技术

羧酸酯酶1(Carboxylesterase 1，CES1，EC 3.1.1.1)属于丝氨酸水解酶家族，在哺乳动物体内广泛存在。在人体中，CES1主要分布于肝脏，并表现出显著的组织特异性。CES1在亚细胞器中定位于内质网，由C-端连接蛋白负责将CES1固定于内质网，而其活性中心位于蛋白的N-端。CES1偏向于水解大酰基连接小醇基结构的酯、酰胺和硫酯类化合物，是酯类物质催化代谢关键酶。绝大多数羧酸酯酶的底物药物都是酯类(如卢非酰胺，伊立替康和卡培他汀)，硫酯，酰胺及氨基甲酸盐是羧酸酯酶的潜在底物。绝大多数心血管药物，他汀类药物和苯氧酸类都是羧酸酯酶的底物。氯吡格雷80％以上都是被CES1代谢失活的，CES1活性高低直接影响体内氯吡格雷的活性产物浓度，影响氯吡格雷用药的有效性和安全性。在内源性代谢中，CES1是胆固醇酯和脂肪酯代谢的关键酶。这些与脂类代谢疾病相关。CES1被发现与多种肝脏脂质代谢疾病的发生发展存在密切关系，CES1基因敲除小鼠引起肝脏生成升高和肝脏低密度脂蛋白的外泌增加，引发外周组织中的高脂血症和脂肪沉积增加。对CES1进行活性检测可为研究体内药物代谢进程提供指导。

由于CES1在肝脏特异性分布及高分布的特点，我们假设在肝细胞发生损伤破坏时，细胞内CES1可能会像转氨酶等标志物一样释放至胞外甚至血液循环系统，通过分析系统中的肝脏来源的分子，是进行无创检验的重要途径。CES1外泌至胞浆或胞外仍保持水解活性，由于这一特征，CES1活性可以通过肝脏组织中的残留活性以及在血液或细胞外体液中的CES1活性来双重表征，CES1活性表征方法可表征剩余及肝细胞破坏的百分比，以上说明CES1有可能成为肝损伤的评价指标。

目前CES1的主要检测方法有免疫印迹法、蛋白质组学、紫外光谱法、毛细管电泳及荧光检测法。免疫印迹通常是基于抗原抗体特异性结合作用，这种方法通常特异性良好，但是抗体需要低温保存，多次使用易失活，价格昂贵。蛋白质组学方法则需要特定的仪器LC-MS，通过检测蛋白水解后的特定肽段来定量。这种方法存在仪器昂贵，操作步骤繁琐，并且与免疫方法一样，仅能定量或半定量酶的绝对含量。而之前已经报道过，CEs的蛋白表达量与其活性并不是永远呈正相关的。紫外光谱法则是基于水解后吸光度的变化来表示酶的活性，这些底物的特异性较差，无法用于复杂体系中CES1的活性检测。还有一些底物则要通过液相检测。与其他技术相比，荧光检测方法具有灵敏度高，创伤小，实时成像的优点，在分析细胞和组织中CES1中有很大优势。开发灵敏度高、特异性强的CES1探针底物，不仅可以更好地探究CES1在相关疾病中的所发挥的重要作用，还可以为CES1靶点药物的筛选及定量测定生物体系内CES1的活性提供有力的技术支撑。