[发明专利]人AURKB和TM4SF20基因甲基化位点的检测方法和应用

说明书

本发明公开了人AURKB和TM4SF20基因甲基化位点的检测方法和应用，设计了其独有引物，包括PCR扩增引物和甲基化测序引物，其中，所述AURKB基因位点cg11009596的PCR上游引物序列为：biotin‑5’‑GAGTGGGTAGATGATTAGGTAGATTAGA‑3’，下游引物序列为：5’‑CAACACACTAACCCCAATCTAAA‑3’，甲基化测序引物序列为：5’‑CCCTACCTCCTTCCAA‑3’；TM4SF20基因位点cg20683151的PCR上游引物序列为：5’‑TTAATTGAGTTAGGGGTGATTATGA‑3’，下游引物序列为：biotin‑5’‑AAACCAACAAACTAAATCCATTACA‑3’，甲基化测序引物序列为：5’‑GTTAGGGGTGATTATGAT‑3’。本发明在原发性肝细胞癌患者中筛查AURKB基因和TM4SF20基因的特异性位点，设计了针对两位点的PCR引物和焦磷酸测序引物，通过焦磷酸测序技术能对特异性位点的甲基化水平进行快速准确的定量检测。

技术领域

本发明涉及肝癌治疗技术领域，尤其涉及人AURKB和TM4SF20基因甲基化位点的检测方法和应用。

背景技术

肝癌是全球范围内致死率排名第三的恶性肿瘤，也是我国位居第二的癌症“杀手”。目前对肝癌的治疗主要以手术、放化疗为主，同时结合免疫治疗、中医等其他治疗方法；但由于对于肝癌的发病机制尚不明确及缺乏有效的治疗靶点，中后期的病人治疗效果不佳，生存率低。研究表明，肝癌发生发展是一个表观遗传学调控的过程。DNA甲基化是目前表观遗传学研究的热点之一，它是指在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)介导下，以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体，将甲基基团转移到DNA某些碱基上的过程。DNA甲基化异常被认为是发生肿瘤的一个重要原因。研究肝癌相关基因特异性位点甲基化的改变，有助于了解肝癌的发病机理，为肝癌的预防和治疗提供有效的作用靶点。

AURKB基因位于17号染色体短臂1区3带，该基因编码丝氨酸/苏氨酸激酶的极光激酶亚家族的成员。编码这个亚家族其他两个成员的基因位于染色体19和20上。这些激酶通过与微管的结合参与有丝分裂和减数分裂过程中染色体排列和分离的调节。该基因的一个假基因位于8号染色体上。据ArihiroAihara报道，AURKB基因的高表达与肝癌复发相关。但AURKB基因的DNA特异性位点的甲基化与肝癌的关系目前国内外未见报道。

TM4SF20基因位于人2号染色体长臂3区6带，其编码的蛋白质是四次跨膜L6超家族的成员。这个家族的成员通过与整合素的相互作用在各种细胞过程中发挥作用，包括细胞增殖、运动和粘附。在人脑组织中，该基因在顶叶、枕叶、海马、脑桥、白质、胼胝体和小脑中呈高水平表达。敲除小鼠的同源基因导致神经行为表型，提示运动协调性增强。人类基因的缺失突变与特定的语言障碍-5有关。但该基因目前并无与癌症相关的研究报道，其启动子区甲基化异常与肝癌关系不明。

发明内容

1.要解决的技术问题

本发明的目的是为了解决现有技术中尚未提出AURKB基因的DNA特异性位点的甲基化与肝癌关系的问题，而提出的人AURKB和TM4SF20基因甲基化位点的检测方法和应用。

2.技术方案

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

肝癌相关的人AURKB基因甲基化位点，甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的DNA中，AURKB基因的一个位点cg11009596的甲基化水平明显低于癌旁组，差异具有显著性，该特异性位点所在的核酸序列为：

TGGGCGCTGGTCTCACCGCCCCCGCCCTGCTATCGTCCCTACCTCCTTCCAGCCCTGCGGCGTGCGCGCAGGCCAGCCCAACGGACCCTCTGATCTACCTGATCATCTGCCCACTCCCGGCG；