[发明专利]人AURKB和TM4SF20基因甲基化位点的检测方法和应用

权利要求书

1.肝癌相关的人AURKB基因甲基化位点，其特征在于，甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的DNA中，AURKB基因的一个位点cg11009596的甲基化水平明显低于癌旁组，差异具有显著性，该特异性位点所在的核酸序列为：

TGGGCGCTGGTCTCACCGCCCCCGCCCTGCTATCGTCCCTACCTCCTTCCAGCCCTGCGGCGTGCGCGCAGGCCAGCCCAACGGACCCTCTGATCTACCTGATCATCTGCCCACTCCCGGCG；

下划线处碱基为甲基化位点的确切位置，该位点距转录起始位点215个碱基。

2.根据权利要求1所述的肝癌相关的人AURKB基因甲基化位点，其特征在于，焦磷酸测序法定量检测人AURKB基因特异性甲基化位点cg11009596，特异性甲基化位点的引物包括PCR引物和甲基化测序引物，其中，所述PCR上游引物序列为：biotin-5’-GAGTGGGTAGATGATTAGGTAGATTAGA-3’，下游引物序列为：5’-CAACACACTAACCCCAATCTAAA-3’，甲基化测序引物序列为：5’-CCCTACCTCCTTCCAA-3’。

3.人TM4SF20基因甲基化位点，其特征在于，甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的DNA中，TM4SF20基因的一个位点cg20683151的甲基化水平明低于癌旁组，差异具有显著性，该特异性位点所在的核酸序列为：

GAACTACTCCTAACAGCAGTAGAACCAGCAGGCTGAATCCATTGCAGGATGTCCATCCTTCGCAGCAGGTCATGGTCACCCCTGGCTCAGAAACGTTGTCAAAGTGGCTATGCTTGCATGGT；

该位点距转录起始位点11个碱基。

4.根据权利要求3所述的人TM4SF20基因甲基化位点，其特征在于，焦磷酸测序法定量检测人TM4SF20基因特异性甲基化位点cg20683151，特异性甲基化位点的引物包括PCR引物和甲基化测序引物，所述PCR上游引物序列为：5’-TTAATTGAGTTAGGGGTGATTATGA-3’；下游引物序列为：biotin-5’-AAACCAACAAACTAAATCCATTACA-3’；甲基化测序引物序列为：5’-GTTAGGGGTGATTATGAT-3’。

5.根据权利要求1和2所述的人AURKB和TM4SF20基因甲基化位点的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：分别提取原发性肝细胞癌组织及癌旁组织的基因组DNA，分别对所有样本的基因组DNA进行重亚硫酸盐转化，将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；

步骤2：以重亚硫酸盐转化后的人基因组DNA为模板，针对位点(cg11009596、cg20683151)的上下游序列设计所述的PCR引物和测序引物；

步骤3：以重亚硫酸盐转化后的人基因组DNA为模板，利用所述的PCR引物和测序引物进行焦磷酸测序，分析(cg11009596、cg20683151)位点的甲基化水平。

6.根据权利要求1和2所述的人AURKB和TM4SF20基因甲基化位点的应用，其特征在于，应用焦磷酸测序对TM4SF20基因cg20683151甲基化程度进行检测，原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织存在显著性差异；该位点在原发性肝癌中甲基化程度显著降低，该位点甲基化定量信息的改变为了解肝癌的发病机理，寻找到有潜在临床意义的肿瘤预防及治疗靶点提供支持。