[发明专利]一种检测东南亚型HPFH缺失变异的引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明提供了一种利用第三代高通量测序技术平台检测东南亚型HPFH(S.E.Asian‑HPFH，SEA‑HPFH)缺失变异的引物组，试剂盒及方法，本发明通过在东南亚型HPFH缺失区域5’端侧翼设计正向引物，在缺失区域内设计正常内对照(HBB基因区域)5’端侧翼的正向引物以及在东南亚型HPFH缺失区域3’端侧翼与正常内对照(HBB基因区域)3’端侧翼设计共用的反向引物，长片段PCR扩增以及第三代测序文库构建与测序，实现东南亚型HPFH缺失变异的精准快速检测。

技术领域

本发明涉及一种利用第第三代高通量测序技术平台检测东南亚型HPFH缺失变异的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

地中海贫血(Thalassemia)是由珠蛋白基因缺陷引起珠蛋白合成障碍所致的遗传性溶血性疾病，分为α-地中海贫血和β-地中海贫血两种类型。该疾病是全球分布最广、累及人群最多的单基因遗传病，全世界至少有3.45亿人携带地中海贫血基因变异，全球不同国家地区地中海贫血基因变异携带者频率约1-5％。我国南方地区也是地中海贫血高发区域，其中广西、广东发病率尤高。

β-地中海贫血是由β-珠蛋白基因簇变异导致的。全世界已报道的β-珠蛋白基因簇变异有1000多种，其中大部分为点突变，也有少部分为β-珠蛋白基因簇缺失，包括δβ地中海贫血和遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(hereditary persistence of fetalhemoglobin,HPFH)。目前HbVar数据库收录的β-珠蛋白基因簇缺失已有40余种，其中东南亚型HPFH缺失变异是中国人群中常见的以高HbF为表型的β-珠蛋白基因簇缺失变异。东南亚型HPFH缺失变异杂合子常无或仅有轻微的临床症状，但当其合并β-珠蛋白基因点突变时，临床上可表现为中间型或重型β-地中海贫血。鉴于东南亚型HPFH缺失变异在临床上漏诊可能导致严重后果，在地中海贫血高危人群中要高度重视此类地中海贫血的筛查和检测。

目前我国临床上使用的商品化β-地中海贫血基因检测试剂盒仅覆盖了中国人群常见的CD41-42(-CTTT)、CD17(AAGTAG)、IVS-II-654(CT)、-28(AG)、CD71/72(+A)和CD26(GAGAAG)等17种点突变。由于地中海贫血存在高度的遗传异质性，对于罕见变异存在漏诊的风险，这导致缺失型β-地中海贫血的漏诊或误诊尤为明显。在临床工作中如果患者常规地中海贫血基因检测结果与血液学表型和临床表型不符，且高度怀疑为β-地中海贫血时应进一步做罕见β-地中海贫血基因检测以避免漏诊或误诊。东南亚型HPFH缺失范围包括β-珠蛋白基因簇的β基因和3’-HS-1区域，缺失长度约27kb。针对此类基因簇大片段缺失，目前实验室常采用跨越断裂点PCR(Gap-PCR)联合多重连接探针扩增(MLPA)技术进行检测，但两种检测技术均无法精准检测断裂位点，且通量低、成本高、操作繁琐，目前亟需一种精准高效的检测方法以满足临床筛查和诊断需求。

应用二代高通量测序(next-generation sequencing，NGS)进行地中海贫血基因检测可显著提高基因变异的检测时效、检测准确度和检出率，但NGS测序读长(reads)短，仅能检测点突变、小片段插入/缺失、拷贝数变异，不能检测大片段杂合缺失等地中海贫血基因簇复杂结构变异，东南亚型HPFH缺失变异等复杂结构变异仍然存在漏诊可能。以单分子实时测序(single molecule real-time sequencing,SMRT)为代表的第三代高通量测序技术平台可实现对每一条DNA分子的单独测序，具有超长读长(读长可达30kb-100kb)、高准确度(QV30＞99.8％)、无GC偏好性和单分子分辨率的特点。应用第三代高通量测序技术平台进行地中海贫血基因检测可有效覆盖大片段缺失等地中海贫血基因簇复杂结构变异，实现地中海贫血基因簇复杂结构变异的精准检测。

发明内容