[发明专利]一种5种人肠病毒的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，本发明公开了一种5种人肠病毒的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用，所述MNP标记组合包括人肠病毒基因参考序列上的52个标记，具体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.52所示；所述引物核酸如SEQ ID NO.53‑SEQ ID NO.156所示。所述MNP标记组合能特异的鉴定5种人肠病毒并精细的区分每种人肠病毒不同的亚型；所述引物互不干扰，综合多重扩增和测序技术，可一次性对多样本的所有标记组合进行序列分析，具有高通量、多靶点、高灵敏和免培养的检测优势，可应用于医学、食品、环境、海关等领域大规模样本的人肠病毒的鉴定和流行株的监测，具有广泛的应用范围，对人肠病毒的监测和防治具有重要意义。

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种5种人肠病毒的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用。

背景技术

人肠病毒是小RNA病毒科的一个属，其遗传物质为RNA病毒，已报道的有脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、致肠细胞病变人孤儿病毒(ECHO，简称埃可病毒)和新型肠道病毒等共70 多个血清型。人是肠道病毒的唯一自然寄主，病毒通过人与人之间的密切接触(通过手指、餐具和食物)传播扩散。粪－口是主要的传播途径，偶然也可以通过飞沫传播。从粪中排病毒的时间较长，可持续几周。肠道病毒属病毒引起的传染病，临床表现轻者只有倦怠，乏力，低热等，重者可全身感染，脑，脊髓，心，肝等重要器官受损，预后较差，并可遗留后遗症或造成死亡。本类疾病分布于世界各地，在热带和亚热带全年都有，在温暖，潮湿，卫生条件差，人群拥挤的地区发病率高。

人肠病毒分布广泛，型类众多，已知的柯萨奇病毒分为a、b两组，a组有约24型病毒，b组有6型病毒；埃可病毒有34个型，除柯萨奇病毒和埃可病毒，人肠病毒还有其他的C型和D型以及68、 69、70、71、72型新型肠道病毒，这就对人肠病毒的检测技术提出了挑战。其中EV71型因为曾引起小儿手足口病的大流行而备受关注，是重点检疫和预防接种的对象。

现有的人肠病毒检测技术主要通过病毒的分离鉴定，依赖于检测病原和抗体进行血清型鉴定、间接或直接免疫荧光法和检测遗传物质的分子检测技术，包括PCR、核苷酸杂交和测序技术。这些技术各有优势，但在时长、操作复杂度、检测通量、检测变异的准确性和灵敏度、成本等方面也存在一个或多个局限。比如病毒分离鉴定操作复杂、耗时长；血清型鉴定、间接或直接免疫荧光法容易出现交叉反应，导致检测不准确，且不能监测变异；PCR检测技术主要是针对一种病毒的单个亚型的1到2个标记进行检测，效率低下，且容易由于病毒的变异导致检测失败。宏基因组测序技术是另一种检测人肠病毒的技术，但其往往包括大量的宿主测序数据，对低病毒载量的样本进行检测时，尤其需要超深度的测序，导致高的成本。因此，开发快速、准确的、一次性高通量的检测分型多种人肠病毒的人肠病毒检测分析方法对于人肠病毒的检测和防疫都具有重要意义。

本发明开发了新型分子标记-MNP标记，并融合超多重PCR扩增和高通量测序技术分析检测MNP标记，一次性对成百上千份样本的数万个MNP标记进行分型，实现对人肠病毒的高通量、灵敏检测和精准分型，具有样本需要量少、同时覆盖柯萨奇病毒、埃可病毒、C型、D型和EV71型人肠病毒，诊断结果精确，节约数据量、检测亚型的优势。

MNP标记是指在基因组上一段区域内由多个核苷酸引起的多态性标记。与传统的SSR标记和SNP标记相比，MNP标记具有以下优势：(1)等位基因型丰富，单个MNP标记上有2ⁿ种等位基因型，高于SSR和SNP；(2)物种区分能力强，只需要少量的MNP标记就能实现物种鉴定，减少了检测错误率。基于超多重PCR结合二代高通量测序技术检测MNP标记的MNP标记法具有以下优势：(1)输出的是碱基序列，无需平行实验，可构建标准化的数据库进行共享共用；(2)高效率，利用样品DNA条形码，突破测序样品数量的局限，可一次性对成百上千份样本的数万个MNP标记分型；(3)高灵敏度，利用多重PCR一次检测多个靶标，避免单个靶标扩增失败导致高的假阴性和低的灵敏度；(4)高准确性，利用二代高通量测序仪对扩增产物测序数百次。