[发明专利]一种叶绿体基因组高变位点及其检测方法与应用

说明书

本发明属于生物信息技术领域，公开了一种叶绿体基因组高变位点及其检测方法与应用，所述叶绿体基因组高变位点由一对引物序列确定，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；所述叶绿体基因组高变位点的检测方法包括：合成引物；提取待分析柑桔类材料的基因组总DNA，PCR扩增获得高变位点序列；将扩增产物进行电泳检测，回收目的DNA片段；将目的DNA片段加尾，获得重组T载体；将重组T载体转化大肠杆菌感受态细胞；蓝白斑筛选，挑取白色单菌落恒温培养，菌液测序。本发明通过对该序列进行基因组扩增、克隆、测序和比对分析，可以较好地判断不同柑桔果树的胞质来源，实现对柑桔类果树的类群区分。

技术领域

本发明属于生物信息技术领域，尤其涉及一种叶绿体基因组高变位点及其检测方法与应用。

背景技术

目前，由于无融合生殖、属种间易于杂交、无性变异容易发生以及栽培广泛、历史悠久等的影响，柑桔类果树形成了丰富的物种类群，对这些众多的类群进行分辨，厘清彼此间的遗传和进化关系，即使是长期从事柑桔专业研究的学者都非常困难，因此国际上才出现了差异明显的众多柑桔分类系统，如美国W.T.Swingle的大种分类法，日本田中长三郎的小种分类法，以及国内曾勉先生提出的植物分类与园艺分类密切结合的分类方法。W.T.Swingle将柑桔类植物划分为真正柑桔组，包括6属，其中的柑桔属栽培价值最高，划分为16种，8变种。田中长三郎则将柑桔类植物划分为4个属，承认145个种。曾勉先生则将柑桔属拆分为5属5亚属36个种。

对柑桔类果树的类群进行辨识，一般依据形态学、生化物质和/或遗传物质的特征特性。形态学性状直接简便，时效快，检测的费用较低，但分辨效率和准确性较低，不仅受到环境变化的极大影响，在不同时间地点容易出现同物异形和异物同形的现象，而且形态指标的数量和类型也比较有限，全面、真实、准确的测试和分析难以大量展开，使得真实全面地反映遗传上的差异比较困难。生化物质特征差异较大，果实中有无苦油滴是传统柑桔分类中常用的指标，比较简便快捷，但柚皮苷、陈皮素等成分则提取检测的难度高，费用高，其分辨效率和准确性也较低，同样受到环境变化的较大影响。形态学性状和生化物质指标归根结底都是由遗传决定的，遗传的物质基础是DNA，基本不受环境变化的影响，因此遗传物质指标是更基础的指标，其准确性和分辨效率更高，容易得到无歧义的结果，随着聚合酶链式扩增技术、测序技术等的快速发展，遗传物质指标的检测快捷性提升，费用降低，已得到更多的应用。

对于高等植物，遗传的物质基础不仅包括完整的核基因组序列，还涉及线粒体和叶绿体等位于细胞质的基因组序列。显花植物在有性繁殖过程中，核基因组会发生大量的遗传重组，产生大量的遗传变异，针对核基因组开发的分子标记能检测和追踪到来自父母本的遗传变异，目前已有众多的开发应用。叶绿体基因组则具有母性遗传、相对分子量小、进化缓慢、基因序列和基因含量上高度保守等特点，在分析遗传进化、高级类群和胞质杂种鉴定等方面有特别价值，但除了数量不多的通用cpSSR标记外，目前尚缺乏其它类型的高效标记。

植物叶绿体基因组序列一般长约130～150kb，比核基因组小许多，通过二代测序片段的组装，能够相对容易地获得完整基因组，但其长度对展开详细的分析仍比较困难，而且植物体的叶绿体众多，可能存在有差异的叶绿体基因组，表现为杂合，难以通过简单组装完成较全面的分析。同时，叶绿体基因组比较保守，在亲缘关系相近的物种中，基因组的大部分序列非常相似甚或一致，其分析对个体鉴定没有贡献或贡献有限，如2017年对黑猩猩的基因组测序和人类基因组的比较发现，黑猩猩和人类基因组的DNA序列相似性达到99％，即使考虑到DNA序列插入或删除，两者的相似性也有96％。发现对类群或个体差异有贡献的序列差异位点，再对这些位点进行深入分析，将减少大量相似序列的干扰，极大地降低研究难度，减少分析和测试的费用和时间，方便对不同需求下，更多个体和材料的分析研究和鉴定。因此，亟需一种新的叶绿体基因组高变位点及其检测方法，以填补现有技术的空白。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：