[发明专利]一种叶绿体基因组高变位点及其检测方法与应用

权利要求书

1.一种叶绿体基因组高变位点，其特征在于，所述叶绿体基因组高变位点由一对引物序列确定，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

2.一种如权利要求1所述叶绿体基因组高变位点的叶绿体基因组高变位点的扩增检测方法，其特征在于，所述叶绿体基因组高变位点的扩增检测方法包括以下步骤：

步骤一，合成用于扩增叶绿体基因组高变位点序列的引物；

步骤二，提取待分析柑桔类材料的基因组总DNA，DNA聚合酶链式反应PCR扩增获得高变位点序列；

步骤三，将扩增产物加入琼脂糖凝胶孔中进行电泳检测，回收目的DNA片段，片段大小为100bp～500bp；

步骤四，将回收的目的DNA片段加尾，采用克隆载体pGEM-T-easy获得重组T载体；将连接好的重组T载体转化大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5α；蓝白斑筛选，挑取白色单菌落5～6个，LA液体培养基37℃恒温摇床振荡过夜培养，菌液送测序公司测序。

3.如权利要求2所述叶绿体基因组高变位点的扩增检测方法，其特征在于，所述扩增检测方法进一步包括：

根据上下游引物，截取整理样品的测序数据，与提供的主要柑桔类群的叶绿体基因组高变位点的序列长度及SNP、SSR和Indel组合特征表或参考样品中获得的相应序列进行比对分析，实现对柑桔的胞质来源、柑桔类群和柑桔种苗进行鉴定。

4.如权利要求2所述叶绿体基因组高变位点的扩增检测方法，其特征在于，步骤一中，所述引物序列纯度为丙烯酰胺凝胶电泳纯化级别；

步骤二中，所述PCR体系如下：1×PCR Buffer，1.5mmol·L^-1的MgCl₂，0.2mmol·L^-1的dNTPs，0.33nmol·L^-1的上、下游引物，1U的Taq DNA聚合酶，DNA模板10ng，总体积50μL。

5.如权利要求2所述叶绿体基因组高变位点的扩增检测方法，其特征在于，步骤二中，所述PCR的扩增程序为：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，24个循环；72℃延伸5min；PCR产物4℃保存备用。

6.一种如权利要求1所述叶绿体基因组高变位点在柑桔胞质来源、柑桔遗传进化研究、品种资源收集、柑桔类群和柑桔种苗鉴定中的应用。

7.如权利要求6所述叶绿体基因组高变位点在柑桔胞质来源、柑桔遗传进化研究、品种资源收集、柑桔类群和柑桔种苗鉴定中的应用，其特征在于，所述叶绿体基因组高变位点对柑桔胞质来源、柑桔类群和柑桔种苗鉴定的方法，包括：

(1)通过给定引物扩增柑桔基因组，得到目标短序列并进行克隆测序分析；

(2)根据高变位点序列的SSR、Indel和/或SNP的变异特性或变化组合，对柑桔的胞质来源、柑桔类群和柑桔种苗进行鉴定。

8.如权利要求6所述叶绿体基因组高变位点在柑桔胞质来源、柑桔遗传进化研究、品种资源收集、柑桔类群和柑桔种苗鉴定中的应用，其特征在于，所述叶绿体基因组高变位点对柑桔胞质来源、柑桔类群和柑桔种苗鉴定的方法，还包括：

根据正反向引物序列从测序公司返回的测序数据中截取目标片段序列，与提供的“主要柑桔类群的叶绿体基因组高变位点的序列长度及SNP、SSR和Indel组合特征表”或参考样品中获得的相应序列进行比对分析。

9.如权利要求8所述叶绿体基因组高变位点在柑桔胞质来源、柑桔遗传进化研究、品种资源收集、柑桔类群和柑桔种苗鉴定中的应用，其特征在于，所述柑桔类群的代表序列，是以“国家果树种质-重庆柑桔资源圃”收集保存的不同类型柑桔种质资源材料的测序和克隆分析为基础，总结概括获得，用于反映不同柑桔类群材料之间的差异。

10.如权利要求6所述叶绿体基因组高变位点在柑桔胞质来源、柑桔遗传进化研究、品种资源收集、柑桔类群和柑桔种苗鉴定中的应用，其特征在于，所述叶绿体基因组高变位点对柑桔类群和柑桔种苗鉴定的方法中，使用由所述引物扩增得到的叶绿体基因组高变位点序列。