[发明专利]鉴定烟草野火菌生理小种类型的分子标记、引物对及其应用

说明书

本发明公开鉴定烟草野火菌生理小种类型的分子标记、引物对及其应用。本发明首先公开了鉴定烟草野火菌生理小种类型的引物对，所述引物对由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成。本发明进一步公开了鉴定烟草野火菌生理小种类型的如SEQ ID NO.3所示的分子标记。本发明还公开了上述引物对及分子标记在鉴定烟草野火菌生理小种类型中的应用。本发明首次发现了烟草野火菌的特异分子标记，通过检测不同烟草野火菌中该分子标记的有无，快速、准确地将烟草野火菌划分为0号和3号生理小种与1号和2号生理小种两类，操作简单易行，大大降低了工作量，对烟草抗病育种具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及鉴定烟草野火菌生理小种类型的分子标记、引物对及其应用。

背景技术

烟草野火病是危害烟叶生产的主要细菌性病害之一。野火病主要危害烟草叶片，也可侵染花、蒴果和种子，在烟草整个生育期均可发生，如果野火病发生在烟草苗期，防治不及时极易造成毁灭性损失。野火病菌自然侵染烟草叶片初期，表现为侵染部位中心有一个褐色坏死的圆点，周围围绕宽的圆形黄色晕圈(直径约1厘米)。多雨高湿天气下，相邻病斑扩展融合，后期穿孔导致叶片破碎。近年，辽宁、黑龙江、云南等省份野火病在多雨潮湿的季节发病率上升，成为危害中国烟叶生产的主要细菌性病害，给烟叶成产造成巨大损失。烟草野火病致病菌为丁香假单胞杆菌烟草致病变种(Pseudomonas syringae pv.tabaci，Pta)，属于假单胞杆菌属，菌体杆状，无荚膜，不产生芽孢，单生，两端钝圆，鞭毛极生1～4根。野火病菌革兰氏染色阴性，生长适温为24～28℃，在金氏B培养基上生长较好，可产生绿色荧光。野火病菌除侵染烟草外，人工接种还能侵染大豆、菜豆、番茄、辣椒、马铃薯、黄瓜、龙葵等植物。目前，除通过烟草病理实验观察发病症状、生理生化实验外，也通过16S rRNA和tabA等特异基因检测来鉴定野火病菌。

国际上通常以野生烟草长花烟和栽培种黄花烟，或者以二者抗性来源的普通栽培烟草作为抗性鉴别宿主来区分野火菌的生理小种。目前已知野火菌有4个生理小种，能侵染普通栽培烟草(不含任何抗野火病基因的)而不能侵染长花烟的野火菌株为0号生理小种，能侵染长花烟而不能侵染黄花烟的为1号生理小种，既能侵染黄花又能侵染长花烟的为2号生理小种，能侵染黄花烟而不能侵染长花烟的为3号生理小种。确定烟草种植区的野火菌生理小种分布情况，是进行下一步烟草抗病育种的关键，而抗野火病烟草品种的培育是未来烟草绿色农业的优先发展方向。目前鉴定野火菌生理小种都是采用在抗性鉴别宿主烟草上接种待测菌株的植物病理试验来实现。但接种试验存在一些缺陷，一是难于控制接种剂量和接种浓度，当接种量过大接种浓度过高时，在抗病烟草上容易产生超敏反应的情况。二是野火菌在抗病烟草上因超敏反应产生的免疫斑有时与正常的野火病斑易于混淆，给结果判定带来困难。这些缺陷都给接种试验的准确性造成了影响，需要设置大量试验重复以提高鉴定的准确性。

因此，需要提供一种鉴定准确性高，且简单易行、工作量少的鉴定烟草野火菌生理小种类型的方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种简单易行、准确性高和工作量少的鉴定烟草野火菌生理小种类型的引物对及分子标记。

本发明的另一个目的在于提供上述引物对及分子标记在鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌生理小种类型中的应用。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明首先提供了一种鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌生理小种类型的引物对，所述引物对由上游引物WFF1和下游引物WFR1组成：

所述上游引物WFF1为SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子；所述下游引物WFR1为SEQID NO.2所示的单链DNA分子。

包含上述引物对的试剂盒也在本发明的保护范围之内，所述试剂盒为鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌生理小种类型的试剂盒。