[发明专利]一种个体化检测胃癌患者腹腔微小转移灶预测腹膜转移的方法

说明书

本发明涉及一种个体化检测胃癌患者腹腔微小转移灶预测腹膜转移的方法，可依次包括如下步骤：(1)收集患者的肿瘤组织、血液和腹腔冲洗液并进行DNA提取和建库；(2)将(1)中肿瘤组织文库和血液白细胞文库进行外显子测序并选择突变位点，设计引物组合；(3)将(2)中的引物组合在(1)中的冲洗液文库中进行扩增；(4)分析冲洗液突变的真假；(5)根据突变结果计算冲洗液中肿瘤细胞比例，评估腹膜转移风险。本发明公开了个体化检测腹腔冲洗液中胃癌组织突变的检测方法和数据分析方法。本发明对于胃癌患者腹腔冲洗液的肿瘤特异性突变检测，有助于在转移灶发生的早期预测患者的腹膜转移，实现对早期腹膜转移患者的早期干预，延长患者生存时间，提高患者生存质量。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种在胃癌患者腹腔冲洗液中设计个体化Panel检测腹腔微小转移病灶的方法。

背景技术

腹膜转移(Peritoneal dissemination，PD)是胃癌患者术后的一种常见转移形式，约占转移患者的50％。由于腹腔内部的环境复杂，且常规的化疗药物难以到达腹腔，当胃癌患者发展为影像学可见的腹膜转移灶时，后续的治疗效果差，同时患者往往伴随着肠梗阻和腹水等并发症，所以腹膜转移患者的5年生存率仅为13％。虽然目前在临床上有腹腔热灌注化疗和术中广泛腹腔灌洗加腹腔内化疗等手段预防胃癌患者的腹腔转移，但是由于无法预测哪些患者会发展为腹膜转移，所以临床上对腹腔内化疗的应用有限。因此对胃癌患者腹膜转移进行预测可以在腹膜转移的早期进行治疗干预，延长胃癌腹膜转移患者的生存时间。

目前临床上进行腹膜转移预测的常用方法是细胞学检测，但细胞学检测的灵敏度很低，仅为30％，许多患者因为漏检不能得到早期有效的预防性治疗，远远不能满足临床的需求。在腹膜转移的早期，由于肿瘤细胞比例极低，基于qPCR的mRNA检测和其他蛋白标志物的检测无法检出由肿瘤细胞引起的腹腔环境的改变。基于二代测序技术的个体化突变检测，可以实现超高测序深度(大于十万乘)、达到极低的检测下限(十万分之一)，能够实现低比例肿瘤细胞的检测，可以应用于肿瘤的早期筛查、疗效预测和预后监测等。因此我们根据胃癌患者的肿瘤组织特异性突变，设计个体化的检测Panel，在目标患者的腹腔冲洗液中检测肿瘤组织特异性突变，预测胃癌患者的腹膜转移。

发明内容

本发明的目的是通过个体化定制Panel在腹腔冲洗液中检测胃癌患者腹腔里的微小转移病灶，预测腹膜转移。

本发明首先保护一种在冲洗液里进行DNA提取的方法，可依次包括如下步骤：

(1)在胃癌患者切除胃部肿瘤前的腹腔探查阶段，用100ml生理盐水冲洗患者上腹部腹腔，并收集冲洗液；

(2)将(1)中得到的生理盐水经过离心后得沉淀；

(3)将(2)中的沉渣通过蛋白酶消化、细胞裂解、洗脱得到冲洗液沉渣的gDNA。

本发明还保护一种腹腔冲洗液测序文库构建的方法，可依次包括如下步骤：

(1)将腹腔冲洗液的gDNA进行超声打断；

(2)将步骤(1)打断后的DNA样本依次进行末端修复和3’端加A处理：

(3)将步骤(2)处理后的DNA样本与接头混合物中的接头连接；

(4)将步骤(3)得到的连接产物经过PCR扩增后得到文库。

所述接头混合物由12个接头组成，接头混合物的序列见表4，文库构建中的接头混合物和扩增引物详细信息见专利CN110669823A。

序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21和序列23的8个N表示8bp的随机碱基，可作为随机标签。