[发明专利]一种个体化检测胃癌患者腹腔微小转移灶预测腹膜转移的方法

权利要求书

1.一种在冲洗液里进行DNA提取的方法，可依次包括如下步骤：

(1)在胃癌患者开腹后切除胃部肿瘤组织前，用生理盐水冲洗患者的腹腔；

(2)将(1)中得到的生理盐水经过离心后得沉淀；

(3)将(2)中的沉渣通过蛋白酶消化、细胞裂解、洗脱得到冲洗液沉渣的gDNA。

2.一种冲洗液测序文库构建的方法，可依次包括如下步骤：

(1)将冲洗液的gDNA进行超声打断；

(2)将步骤(1)打断后的DNA样本依次进行末端修复和3’端加A处理；

(3)将步骤(2)处理后的DNA样本与接头混合物中的接头连接，经过PCR扩增后得到文库。

3.一种选取胃癌患者肿瘤组织特异性突变位点的方法：

(1)将胃癌患者的肿瘤组织和血液白细胞进行外显子捕获测序；

(2)将(1)得到的测序结果进行外显子突变分析；

(3)针对每个患者的外显子突变列表，优先选取表8中的肿瘤驱动基因，其次选择高频的突变基因，共选取n个肿瘤特异性突变位点；

(4)设计检测n个肿瘤特异性突变位点的引物；

所述n具体可为20。

4.本发明还保护一种个体化检测冲洗液DNA样本中肿瘤突变的试剂盒设计方法，包括上述任一所述接头混合物和引物组合设计方法；所述引物组合包括引物组I、引物组II、引物组III和引物组IV，

所述引物组I和所述引物组II中的各个引物是根据与肿瘤突变相关的区域设计的特异性引物，作用是定位于基因组特定位置，实现目标区域的PCR富集；所述引物组I和所述引物组II分别从正负两个方向检测突变位点；

所述引物组III和所述引物组IV中的各个引物均包括接头序列和特异序列，特异序列用于目标区域进行进一步富集；

所述引物组III和所述引物组I中，针对同一突变位点设计的两个引物为“巢式”关系；

所述引物组IV和所述引物组II中，针对同一突变位点设计的两个引物为“巢式”关系。

5.权利要求4所述的引物组合设计在制备用于检测冲洗液DNA样本中胃癌突变的试剂盒中的应用。

6.一种检测DNA样本中目标突变的方法，包括如下步骤：

(1)按照权利要求2所述的方法构建文库；

(2)对步骤(1)得到的文库进行两轮巢式PCR扩增，对产物进行测序，根据测序结果分析DNA样本中目标突变发生情况；

所述步骤(2)中，采用上游引物1355和引物组I或引物组II进行第一轮PCR扩增；

所述上游引物1355为文库扩增引物，用于步骤(1)的文库扩增；

所述引物组I或引物组II为根据n个目标靶点设计的n条正链扩增引物或负链扩增引物的组合；

以第一轮PCR的产物为模板，采用上游引物3355、index引物和引物组III或引物组IV进行第二轮PCR扩增；

所述上游引物3355和index引物为文库扩增引物，用于第一轮PCR的产物的扩增；

所述引物组III或引物组IV中的引物与引物组I或引物组II中检测相同目标靶点的引物形成巢式关系，各条引物中具有与index引物结合的区段；

所述index引物中包含与引物组III或引物组IV中各条引物结合的区段和index序列。

7.一种检测DNA样本中多种目标突变的方法，包括如下步骤：

(1)按照权利要求2所述的方法构建冲洗液DNA文库；

(2)对步骤(1)的文库进行靶区域富集并进行测序；

(3)根据测序结果分析DNA样本中目标突变发生情况。